循環(huán)腫瘤DNA對(duì)黑色素瘤診斷價(jià)值的Meta分析

萬文婷， 于 波， 弓孟春， 史文釗， 郭 昊， 楊 杰

（1.神州數(shù)碼醫(yī)療科技股份有限公司科學(xué)事務(wù)部，北京 100080；2.南華大學(xué)附屬湘潭醫(yī)院泌尿外科，湖南 湘潭 411101）

黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞過度增殖引起的一種極具侵襲性的皮膚腫瘤，多發(fā)于皮膚黏膜及肢端，雖然其發(fā)病率僅占皮膚腫瘤的10%，但與80%的皮膚腫瘤死亡事件相關(guān)[1]。2018年的全球癌癥報(bào)告表明，黑色素瘤新增病例為287 723例，死亡人數(shù)達(dá)60 712人[2]。在我國(guó)，黑色素瘤Ⅳ期的患者5年生存率＜5%[3]。在黑色素瘤初期，首選手術(shù)切除，而對(duì)于中晚期患者，傳統(tǒng)的放化療等手段起效甚微。針對(duì)不能進(jìn)行手術(shù)切除或已經(jīng)轉(zhuǎn)移并出現(xiàn)BRAFV600E突變的黑色素瘤患者，2011年美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)維莫非尼作為靶向藥物對(duì)黑色素瘤患者進(jìn)行治療，黑色素瘤的治療跨入靶向治療時(shí)代?；驒z測(cè)可以指導(dǎo)靶向治療方案的制定監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。

組織活檢是臨床基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，然而組織活檢存在許多不足之處，如穿刺過程風(fēng)險(xiǎn)高、解剖位置不佳、價(jià)格高、操作復(fù)雜、腫瘤組織自身的異質(zhì)性等。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測(cè)是近年來被用于檢測(cè)人體內(nèi)基因突變的新興方法。ctDNA是腫瘤細(xì)胞DNA脫落或凋亡后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段，是一種特殊的腫瘤標(biāo)志物[4]，其具有非侵入性、易獲取、可連續(xù)取樣、可克服腫瘤異質(zhì)性等優(yōu)點(diǎn)，可作為組織活檢的補(bǔ)充用于臨床的診斷和疾病監(jiān)測(cè)。PINZANI等[5]指出，在黑色素瘤患者中，與腫瘤組織的檢測(cè)結(jié)果相比，ctDNA檢測(cè)的敏感性為72%，特異性為89%，與腫瘤病理檢測(cè)結(jié)果一致性為80%。TANG等[6]的報(bào)道顯示，在58名黑色素瘤患者中，ctDNA與腫瘤組織的檢測(cè)結(jié)果一致性為70%。HASELMANN等[7]在一項(xiàng)對(duì)187名黑色素瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)，乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（bead，emulsion，amplification and magnetic，BEAMing）可以提高ctDNA的檢測(cè)敏感性（86%）和特異性（93%），并且一致性高達(dá)90%，提示ctDNA具有較好的診斷價(jià)值。由于ctDNA檢測(cè)的準(zhǔn)確率受到檢測(cè)儀器、樣本來源、疾病分期等多種因素的影響，目前對(duì)于其臨床應(yīng)用價(jià)值仍存在爭(zhēng)議。

本研究通過定量Meta分析，評(píng)估配對(duì)的黑色素瘤組織樣本和外周血中ctDNA基因突變檢測(cè)結(jié)果的一致性，為臨床應(yīng)用提供循證依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 檢索策略

通過Medline、Cochrane Library、Excerpta Medica Database（Embase）、中國(guó)知網(wǎng)及維普數(shù)據(jù)庫進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，檢索數(shù)據(jù)收集時(shí)間為從建庫至2019年1月。語言限定為中文和英文。中文檢索詞為“黑色素瘤”、“ctDNA”、“循環(huán)游離DNA”；英文檢索詞為“Melanoma”、“circulating tumor DNA”、“circulating cellfree DNA”，并且通過人工檢索進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組患者均為確診的黑色素瘤患者；（2）可獲得血液中ctDNA的基因突變檢測(cè)結(jié)果；（3）具有配對(duì)的病理組織的基因突變檢測(cè)結(jié)果；（4）文獻(xiàn)中有足夠的數(shù)據(jù)可以直接或間接計(jì)算得到假陽性（false positivity，F(xiàn)P）、假陰性（false negativity，F(xiàn)N）、真陰性（true negativity，TN）和真陽性（true positivity，TP）的值。文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）綜述、案例報(bào)道、評(píng)論等文獻(xiàn)；（2）沒有檢測(cè)組織或者沒有檢測(cè)血液中的基因突變，或者血液與組織沒有一一配對(duì)；（3）數(shù)據(jù)不全；（4）非人體研究；（5）＜10人的研究。

1.3 資料提取與質(zhì)量評(píng)價(jià)

由2名科研人員分別從事篩選文獻(xiàn)、質(zhì)量評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)提取的工作，后期進(jìn)行匯總和核對(duì)。如果遇到意見不一致，提交至第3位研究人員決定。數(shù)據(jù)提取信息如下：第一作者姓名、文獻(xiàn)發(fā)表年份、國(guó)家、TNM分期、是否轉(zhuǎn)移、樣本量、組織樣本的類型、血液樣本類型、血液中基因突變的檢測(cè)方法及突變基因位點(diǎn)，結(jié)果指標(biāo)包括TP、FP、FN、TN的值和檢測(cè)敏感性、特異性、結(jié)果的一致性。用診斷準(zhǔn)確性研究質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)-2（QUADAS-2）量表對(duì)入組文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。QUADAS-2量表主要由4個(gè)部分組成：病例的選擇、待評(píng)價(jià)試驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展情況。測(cè)評(píng)所有組成部分的偏移風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)測(cè)評(píng)前3部分臨床適用性?；诿坎糠旨{入的相關(guān)標(biāo)志性問題作出“是”、“否”或“不確定”的判斷，可對(duì)應(yīng)將偏移風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)確定為“低”、“高”或“不確定”。在偏移風(fēng)險(xiǎn)判斷上納入與偏移潛在性有關(guān)的標(biāo)志性問題，旨在幫助評(píng)價(jià)者判斷偏移風(fēng)險(xiǎn)，但臨床適用性的判斷未納入標(biāo)志性問題[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過Spearman相關(guān)系數(shù)檢查有無閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。非閾值效應(yīng)的異質(zhì)性以I2和Q檢驗(yàn)為指標(biāo)，當(dāng)I2＞50%或P＜0.05時(shí)，表明異質(zhì)性顯著，選用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算；當(dāng)I2＜50%或P＞0.05時(shí)，表明異質(zhì)性不顯著，則選用固定效應(yīng)模型計(jì)算。通過Stata 15.0軟件，基于FP、FN、TN和TP的值，計(jì)算敏感性、特異性、綜合受試者工作曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）、合并陽性似然比（positive likelihood ratio，PLR）、合并陰性似然比（negative likelihood ratio，NLR）、合并診斷優(yōu)勢(shì)比（diagnostic odds ratio，DOR）以及相應(yīng)的95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。使用Deeks'漏斗圖分析是否存在發(fā)表偏移，當(dāng)P＜0.10時(shí)表明存在發(fā)表偏移。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索

基于5個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，共收集到英文文獻(xiàn)408篇，中文文獻(xiàn)36篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)40篇，經(jīng)過閱讀文獻(xiàn)標(biāo)題及摘要內(nèi)容后初篩排除文獻(xiàn)337篇。后續(xù)通過仔細(xì)閱讀全文進(jìn)行進(jìn)一步篩查，共計(jì)排除文獻(xiàn)57篇，其中包括沒有組織檢測(cè)結(jié)果的文獻(xiàn)20篇，結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)不全的文獻(xiàn)21篇，研究對(duì)象＜10人的文獻(xiàn)5篇，非人體研究文獻(xiàn)1篇，非黑色素瘤相關(guān)研究文獻(xiàn)2篇，組織樣本與血液樣本無法配對(duì)的研究文獻(xiàn)2篇，綜述4篇，案例報(bào)道1篇和回復(fù)信1篇。最終有10篇文獻(xiàn)符合入組標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 納入文獻(xiàn)基本特征

符合入組標(biāo)準(zhǔn)的10篇文獻(xiàn)中，有4篇來自歐洲，6篇來自北美洲，文獻(xiàn)對(duì)象包括1 360例；文獻(xiàn)多發(fā)表于近5年（6/10）；研究對(duì)象主要以Ⅲ～Ⅳ期的患者為主（9/10）；ctDNA的檢測(cè)方法主要有等位特異聚合酶鏈反應(yīng)（allele-specific polymerase chain reaction，allelespecific PCR）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）和BEAMing等。見表1。

2.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)估與發(fā)表偏移

根據(jù)QUADAS-2的標(biāo)準(zhǔn)，我們從4個(gè)方面對(duì)每項(xiàng)研究的方法學(xué)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估（圖2）。在待評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，有6項(xiàng)研究未提到使用盲法進(jìn)行測(cè)試，另外3項(xiàng)研究是在知道組織檢測(cè)結(jié)果下進(jìn)行的研究，因此均存在未知或較大的風(fēng)險(xiǎn)偏移。由于并非所有患者都被納入，或待評(píng)價(jià)研究與金標(biāo)準(zhǔn)之間存在不恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，因此有8項(xiàng)研究的病例流程和進(jìn)展情況的偏移風(fēng)險(xiǎn)未知或較高。在所有的研究中，適用性都很高。Deeks'漏斗圖顯示，文獻(xiàn)存在發(fā)表偏移（P=0.03），見圖3。

2.4 異質(zhì)性檢驗(yàn)

在診斷試驗(yàn)中，引起異質(zhì)性的原因之一就是閾值效應(yīng)。本研究的Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.267，P=0.455，提示各項(xiàng)研究間不存在由閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。Q檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)結(jié)果表明，本研究不存在異質(zhì)性（合并效應(yīng)量I2值為0，Q值為1.480，P=0.239）（表2）。因此我們選用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。

2.5 合并診斷效能

如圖4所示，10項(xiàng)研究的合并敏感性為0.71（95%CI為0.63～0.79），合并特異性為0.94（95%CI為0.91～0.96），提示陰性結(jié)果的檢出率高；合并AUC為0.94（95%CI為0.92～0.96），說明ctDNA診斷具有較高的準(zhǔn)確率（圖5）。DOR值為37（95%CI為19～71），提示ctDNA具有較好的診斷效能。此外，PLR為11.3（95%CI為7.2～17.5），NLR為0.31（95%CI為0.23～0.41）。

表1 入組文獻(xiàn)的基本特征

圖2 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)圖

圖3 Deeks'漏斗圖

2.6 特征分析

根據(jù)疾病的TNM分期、ctDNA檢測(cè)的方法、檢測(cè)基因、研究對(duì)象例數(shù)等特征進(jìn)行分析（表2）。來自北美洲的研究合并敏感性為0.76（95%CI為0.69～0.81），合并特異性為0.94（95%CI為0.85～0.98），合并AUC為0.81（95%CI為0.78～0.85），合并DOR為47（95%CI為14～152），合并PLR為12.2（95%CI為4.7～32.1），合并NLR為0.26（95%CI為0.19～0.35），合并后異質(zhì)性I2=0；來自歐洲的研究合并敏感性為0.60（95%CI為0.48～0.71），合并特異性為0.92（95%CI為0.85～0.96），合并AUC為0.90（95%CI為0.87～0.92），合并DOR為18（95%CI為8～40），合并PLR為7.8（95%CI為4.1～15.0），合并NLR為0.43（95%CI為0.32～0.58），合并后異質(zhì)性I2=0。相較于來自北美洲的研究，來自歐洲的研究具有更高的AUC，而敏感性、特異性、DOR、PLR值更低。檢測(cè)方法不同對(duì)結(jié)果也有影響，在ARMS-PCR方法組中，合并敏感性為0.61（95%CI為0.51～0.71），合并特異性為0.91（95%CI為0.84～0.95），合并AUC為0.87（95%CI為0.84～0.90），合并DOR為16（95%CI為8～33），合并PLR為6.9（95%CI為3.8～12.6），合并NLR為0.43（95%CI為0.33～0.55），合并后異質(zhì)性I2=0。另外，人群樣本量大小對(duì)結(jié)果有影響，在研究對(duì)象≤100人的研究中，合并后異質(zhì)性I2=0，合并敏感性為0.70（95%CI為0.58～0.80），合并特異性為0.91（95%CI為0.82～0.96），合并AUC為0.90（95%CI為0.87～0.92），合并DOR為23（95%CI為8～66），合并PLR為7.7（95%CI為3.5～16.8），合并NLR為0.33（95%CI為0.22～0.49）；在研究對(duì)象＞100人的研究中，合并后異質(zhì)性I2=39，合并敏感性為0.73（95%CI為0.60～0.83），合并特異性為0.95（95%CI為0.92～0.98），合并AUC為0.96（95%CI為0.94～0.97），合并DOR為58（95%CI為26～130），合并PLR為16.1（95%CI為8.8～29.4），合并NLR為0.28（95%CI為0.18～0.43）。

表2 ctDNA在黑色素瘤中診斷價(jià)值的特征分析

圖4 敏感性和特異性森林圖

圖5 ctDNA在黑色素瘤中的綜合受試者工作特征曲線

2.7 敏感性分析

為了解研究結(jié)果的可靠性，分別逐一排除單項(xiàng)研究，對(duì)其余研究進(jìn)行合并分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果可靠。

3 討論

本研究對(duì)10篇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，研究對(duì)象共涉及1 360例。Q檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)結(jié)果表明，合并效應(yīng)量I2值為0，Q值為1.480，P=0.239，不存在異質(zhì)性。ctDNA檢測(cè)的合并敏感性為0.71（95%CI為0.63～0.79），合并特異性為0.94（95%CI為0.91～0.96），合并AUC為0.94（95%CI為0.92～0.96），其中AUC是一個(gè)綜合性指標(biāo)，值越接近1說明診斷價(jià)值越高。合并PLR為11.3，表明黑色素瘤患者中ctDNA檢測(cè)出真陽性的概率約是假陽性的11倍。合并NLR為0.31，說明在ctDNA的陰性結(jié)果中，可能存在31%的假陰性。DOR是實(shí)驗(yàn)組中陽性結(jié)果與對(duì)照組中陽性結(jié)果的比值，能夠較好地反映出診斷試驗(yàn)的“鑒別”能力，DOR值與其鑒別能力呈正相關(guān)[17]。合并DOR為37，提示ctDNA檢測(cè)有較高的綜合診斷效能。

本研究分析了影響ctDNA檢測(cè)準(zhǔn)確度的因素。BOARD等[13]指出ctDNA水平與腫瘤分期高度相關(guān)，ctDNA突變具有腫瘤分期依賴性，一般早期檢測(cè)的準(zhǔn)確率較低。相較于Ⅰ期患者，Ⅳ期患者的ctDNA更高水平[18]，并且ctDNA水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。此外，腫瘤的異質(zhì)性可能致使ctDNA和相應(yīng)的腫瘤組織基因突變檢測(cè)結(jié)果不一致。腫瘤異質(zhì)性來自3個(gè)方面：腫瘤內(nèi)、腫瘤間和時(shí)間異質(zhì)性。組織僅代表所取腫瘤組織部位的突變信息，而ctDNA則代表全部腫瘤組織的突變信息[20]。血液樣本的前期處理方式和檢測(cè)方法也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。目前，不同提取試劑盒的ctDNA提取效率差別很大，并且不同提取方法之間無統(tǒng)一的質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)。敏感性和特異性是評(píng)估檢測(cè)平臺(tái)準(zhǔn)確率高低的2個(gè)重要指標(biāo)。根據(jù)報(bào)道，各種儀器的檢測(cè)敏感性不同，二代測(cè)序、ARMS-PCR、微滴度聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）和BEAMing的檢測(cè)限分別為0.1%～1.0%、0.05%～0.10%、0.001%和0.010%[21-23]。血液中ctDNA水平極低，并且存在正常細(xì)胞的DNA干擾，如何有效提取和準(zhǔn)確檢測(cè)ctDNA是目前亟待解決的問題。

本研究尚存在以下不足：因ctDNA對(duì)黑色素瘤診斷一致性方面的研究較少，故入組文獻(xiàn)較少，文獻(xiàn)質(zhì)量不一，未來仍需納入更多質(zhì)量較高的研究，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)可能產(chǎn)生的異質(zhì)性因素繼續(xù)研究；納入的10項(xiàng)研究存在發(fā)表偏移，可能是由檢索的數(shù)據(jù)庫有限，納入文獻(xiàn)不全導(dǎo)致；納入的文獻(xiàn)以評(píng)估ctDNA與組織活檢結(jié)果的一致性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，存在作者偏向于發(fā)表陽性結(jié)果的可能性；入組文獻(xiàn)納入的病例數(shù)少，會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確度受到影響。

基于目前的研究數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤患者中，ctDNA與配對(duì)的腫瘤組織之間的診斷結(jié)果一致性較高。ctDNA具有低創(chuàng)傷、便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有望成為黑色素瘤基因突變?cè)\斷的輔助方法。希望今后能有更多高質(zhì)量的研究數(shù)據(jù)，為ctDNA黑色素瘤基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。