培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨代謝及骨生物力學(xué)的影響

孫菁 李佳洋 沈沐瑤 朱媛媛 徐道明 郭海英* 王昕玥

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種慢性、全身性疾病，隨著骨組織中骨礦物鹽含量的減少而增加患者骨折風(fēng)險(xiǎn)，并直接導(dǎo)致患者日常生活能力(ADL)和生活質(zhì)量(QOL)的降低[1]。近年來(lái)，人口老齡化速度驟增，2016年中國(guó)60歲以上的人口骨質(zhì)疏松患病率為36%，預(yù)計(jì)至2050年，全世界65歲以上的人口將增加到15.55億，屆時(shí)骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生人數(shù)將增加到626萬(wàn)，相應(yīng)的醫(yī)療支出高達(dá)1 745億元，可見(jiàn)骨質(zhì)疏松已成為中國(guó)面臨的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。過(guò)去的10年里，中醫(yī)藥治療作為一種簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)有效的療法，在一定程度上可以提高骨密度以及改善患者的生活質(zhì)量[2,4]。本文中的培本固疏方是郭海英教授從臨床經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)的自擬方，從正虛絡(luò)瘀的角度治療骨質(zhì)疏松癥，臨床運(yùn)用多年且安全有效。RANKL/RANK/OPG作為骨吸收的經(jīng)典通路,OPG可以競(jìng)爭(zhēng)性地與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化，影響骨吸收[3]。本研究通過(guò)選取大月齡大鼠切除雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型，觀察培本固疏方對(duì)模型大鼠血清骨代謝指標(biāo)及骨生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響，探討培本固疏方治療骨質(zhì)疏松的可能作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康6月齡SPF級(jí)雌性未孕SD大鼠42只，體重約(290±20)g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2018-0006。大鼠飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫為(22±2)℃，濕度在40%～60%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程受南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)監(jiān)督，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)為201905A022。

1.1.2試劑與儀器：中藥培本固疏方由龜板、鹿角片、人參、仙桃草等組成，均采購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂藥房，四味藥按2∶1:1∶2比例配伍，兩次煎液合并后濃縮，分別制成含生藥1、2、4 g/mL的低、中、高不同劑量。西藥：阿侖膦酸鈉(阿拉丁，貨號(hào)A115345)。其他試劑：青霉素G鈉鹽(索萊寶，貨號(hào)P8420)、水合氯醛(阿拉丁，貨號(hào)K1820081)、呂氏堿性美藍(lán)染色液(索萊寶，貨號(hào)G1180)?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRACP5b)試劑盒(貨號(hào)JTE64371)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(貨號(hào)JTE69760)、核因子-κB 受體活化因子配體(sRANKL) 試劑盒(貨號(hào)JTE64083)、骨保護(hù)素(OPG)試劑盒(貨號(hào)JTE60602)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)試劑盒(貨號(hào)JTE69177)，以上ELISA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)、數(shù)字化雙能 X 線骨密度儀(MEDIX-90，法國(guó)MEDILINK公司)、生物力學(xué)測(cè)試儀(MTS Acumen3，美特斯工業(yè)系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型建立：將大鼠稱重后按體重由輕到重進(jìn)行編號(hào)，將體重相鄰6只分為1個(gè)區(qū)組，各區(qū)組內(nèi)參照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，分成假手術(shù)組(SHAM)、模型對(duì)照組(OVX)、中藥低劑量組(D)、中藥中劑量組(Z)、中藥高劑量組(G)和西藥組(X)，每組7只。各組大鼠自由飲食、自然光照，每周稱重1次。大鼠在室溫(22±2)℃、清潔級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用去雙側(cè)卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型[5]。造模前禁食24 h，稱重，左腹部消毒后經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液300 mg/kg麻醉，備皮、酒精消毒后逐層切開(kāi)，找到鮮紅色菜花狀卵巢后切除，結(jié)扎雙側(cè)輸卵管及伴行血管，再逐層縫合。假手術(shù)組僅切除卵巢旁脂肪組織約1 g。術(shù)后各組大鼠均后肢肌注青霉素4萬(wàn)U，連續(xù)注射3 d預(yù)防感染。去勢(shì)組術(shù)后連續(xù)5 d進(jìn)行陰道涂片，染色后顯微鏡下觀察，均表現(xiàn)為動(dòng)情間期(大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞)，表示造模成功[6]。

1.2.2干預(yù):各組均于術(shù)后1月后施行干預(yù)。大鼠等效劑量按成人每日服用劑量的6.3倍進(jìn)行換算。中藥低劑量組:含培本固疏方生藥5.302 5 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃；中藥中劑量組:含培本固疏方生藥10.605 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃；中藥高劑量組:含培本固疏方生藥21.21 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃；西藥組:阿侖膦酸鈉水溶液1 mL/(kg·d)進(jìn)行灌胃；假手術(shù)組和模型對(duì)照組:給予等容量0.9%生理鹽水0.5 mL/100 g進(jìn)行灌胃。各組藥劑均隔水溫?zé)岷蠊辔福辔赋掷m(xù)8周[6]。

1.2.3標(biāo)本采集及測(cè)定方法：大鼠末次施治后，禁食24 h，次日取材。取材前將大鼠稱重，麻醉方法同造模，行腹主動(dòng)脈取血處死。

1.2.4骨密度檢測(cè)：將新鮮股骨標(biāo)本統(tǒng)一方位放于有機(jī)玻璃盒支架上固定，股骨全長(zhǎng)的1/2處作為股骨中段的測(cè)量點(diǎn)，股骨全長(zhǎng)的中上1/4處作為股骨近端的測(cè)量點(diǎn)，用MEDIX-90雙能X線骨密度儀掃描，得出BMD，連續(xù)測(cè)量2次，計(jì)算股骨近端及股骨中段的精確度以變異系數(shù)的均方根(RMS-CV)表示分別為：0.006、0.008。

1.2.5三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：用MTS Acumen3 生物力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨距設(shè)為25 mm，加載速度為2 mm/min，直至股骨斷裂，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果繪制載荷-位移曲線。根據(jù)曲線圖得出股骨彈性模量、彈性載荷、極限載荷。

1.2.6血清代謝指標(biāo)：血液采集后4 ℃靜置4～6 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液。用酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測(cè)血清骨代謝指標(biāo)OPG、sRANKL、TRACP5b的含量以及氧化應(yīng)激指標(biāo)AGEs、MDA的含量。

1.2.7子宮指數(shù)：仔細(xì)剔除子宮周?chē)窘M織后稱重，計(jì)算子宮指數(shù)。子宮指數(shù)=子宮濕重/大鼠體重×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及子宮指數(shù)的比較

因造模及灌胃過(guò)程中的種種因素每組各死亡1只，入組6只。剔除死亡大鼠的體重?cái)?shù)據(jù)后進(jìn)行比較，各組大鼠造模前體重?zé)o差異，具有可比性(P>0.05)。與SHAM組比較，OVX組、X組體重明顯高于SHAM組(P<0.05)，子宮濕重(P<0.01)、子宮指數(shù)(P<0.01)低于SHAM組，也從側(cè)面證實(shí)造模成功。與OVX相比，Z組體重低于OVX組(P<0.05)，子宮指數(shù)高于OVX組(P<0.05)。G組體重低于OVX組(P<0.01)，子宮指數(shù)高于OVX組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及子宮指數(shù)比較Table 1 Comparison of body mass and uterus index between rats in each

2.2 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度的影響

與SHAM比較，OVX組股骨近端、股骨中段骨密度均有所降低(P<0.05)；Z組、G組股骨近端、股骨中段骨密度低于SHAM組，但組內(nèi)比較無(wú)明顯差異。與OVX組比較，Z組、G組、X組均可以提高骨密度(P<0.05)；Z組、G組、X組兩兩比較無(wú)明顯差異。其中西藥可以顯著提高股骨近端骨密度，效果優(yōu)于中藥。具體見(jiàn)表2。

2.3 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨生物力學(xué)的影響

與SHAM組相比，OVX組、D組彈性載荷、極限載荷、彈性模量均顯著低于SHAM組(P<0.01)。與OVX組比較，G組及X組均提高了股骨的彈性載荷、極限載荷和彈性模量(P<0.05)，但Z組僅改善了股骨的彈性模量(P<0.05)，彈性載荷和極限載荷稍有增加，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與X組比較，D、Z組彈性載荷、極限載荷和彈性模量明顯低于X組(P<0.05)，G組彈性模量低于X組(P<0.05)，彈性載荷、極限載荷稍低于X組，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見(jiàn)表3。

表2 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度的影響Table 2 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone mineral density in ovariectomized

表3 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone biomechanical index of ovariectomized

2.4 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

與SHAM組相比，OVX組大鼠血清骨代謝指標(biāo)TRACP5b的含量顯著高于SHAM組，OPG的含量顯著低于SHAM組(P<0.01)，sRANKL含量高于SHAM組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OPG/sRANKL比值低于SHAM組(P<0.05)。與OVX組比較，Z組TRACP5b含量低于OVX組(P<0.05)，OPG的含量顯著高于OVX組(P<0.01)，sRANKL含量低于OVX組(P<0.05)，OPG/sRANKL比值高于OVX組(P<0.05)；G組TRACP5b含量低于OVX組，OPG的含量高于OVX組(P<0.05)，sRANKL含量低于OVX組(P<0.05)，OPG/sRANKL比值高于OVX組(P<0.05)；X組TRACP5b含量低于OVX組(P<0.05)，OPG的含量明顯高于OVX組(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響Table 4 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone metabolism index in ovariectomized

2.5 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與SHAM組對(duì)比，OVX組大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、AGEs的含量均高于SHAM組(P<0.01)。與OVX組比較，Z組MDA含量明顯低于OVX組(P<0.05)，AGEs含量顯著低于OVX組(P<0.01)，G組MDA、AGEs含量均低于OVX組(P<0.05)。與OVX組相比，培本固疏方中藥組均可一定程度上改善氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的含量，Z組優(yōu)于G組，但兩組內(nèi)比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；X組含量與OVX組相當(dāng)，未能明顯改善氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量。見(jiàn)表5。

表5 培本固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 5 Effect of Peiben Gushu Decoction on oxidative stress index in ovariectomized

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥包括因絕經(jīng)后激素水平下降引發(fā)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和70歲以上老年人常見(jiàn)的老年性骨質(zhì)疏松癥，兩者共同的特點(diǎn)是隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)病率增高，衰老是二者共同的危險(xiǎn)因素[2]。文獻(xiàn)[7]表明，機(jī)體氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)可導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)發(fā)生復(fù)制性衰老，縮短端粒長(zhǎng)度，使其分化能力下降，尤其是使BMSCs成脂分化增強(qiáng),成骨分化減弱，加速骨質(zhì)疏松進(jìn)程。衰老會(huì)增強(qiáng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)亦會(huì)促進(jìn)機(jī)體衰老，兩者之間形成一種惡性循環(huán)，抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收。

《素問(wèn)·痿論》[8]：“腎者水臟，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”?！蹲C治準(zhǔn)繩》[9]：“腎肝俱損，骨痿不能起于床，筋弱不能收將，宜益精緩中”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝腎不足為本，脾虛不運(yùn)，氣血不能榮于骨肉，發(fā)為骨痿，故臨床用藥多以補(bǔ)腎、健脾為主?！额惤?jīng)·卷六二十七注》[10]：“腎主骨，骨枯則腎敗矣。脾主肉，肉陷則脾敗矣”?！鹅`樞·經(jīng)脈》[11]：“足少陰氣絕則骨枯，少陰者冬脈也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻，肉軟卻故齒長(zhǎng)而垢發(fā)無(wú)澤，發(fā)無(wú)澤者骨先死”。故筆者認(rèn)為，此病為慢性病程，病久則易五臟虛，以脾腎為主，《臨證指南醫(yī)案》[12]：“病初在經(jīng)，久病入絡(luò)，經(jīng)主氣，絡(luò)主血……”，氣帥血行，氣旺則血自循經(jīng)，氣虛則血滯為瘀，瘀久血不生氣，加重氣虛，氣血痹澀，骨肉不相親，筋弱不用，則發(fā)為骨痿。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥形成的原因有二：一是骨形成不足，二是骨吸收增強(qiáng)。骨脆性增加表示骨易發(fā)生骨折，通常以骨強(qiáng)度大小定義，骨強(qiáng)度高則脆性小，骨強(qiáng)度低則脆性大，[13]。生物力學(xué)已廣泛應(yīng)用于骨強(qiáng)度評(píng)定，所以本次研究的主要觀察指標(biāo)為骨密度，同時(shí)選取彈性載荷、極限載荷、彈性模量進(jìn)行骨強(qiáng)度評(píng)定。結(jié)果表明，培本固疏方能夠在一定程度上提高去勢(shì)大鼠的股骨骨密度、骨強(qiáng)度，降低骨脆性。另外RANKL/RANK/OPG作為骨吸收的經(jīng)典通路,OPG可以競(jìng)爭(zhēng)性地與RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化。隨著年齡的增加，成骨細(xì)胞的存活率降低，骨代謝軸失衡，OPG含量降低和RANKL含量增高可能是骨量流失的重要原因之一[14]。本次研究表明，培本固疏方能提高OPG/RANKL的比值以及OPG的含量，說(shuō)明培本固疏方能促進(jìn)骨形成，改善骨吸收。衰老作為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化劑含量不足，加速自由基氧化，誘發(fā)氧化應(yīng)激，其中MDA、AGEs含量是反映機(jī)體抗氧化能力的重要參數(shù)，MDA反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，AGEs反應(yīng)機(jī)體非酶糖基化的程度，本次研究培本固疏方降低了大鼠血清中MDA、AGEs的含量，說(shuō)明培本固疏方具有一定的抗氧化應(yīng)激作用[15]。

培本固疏方以人參、龜板、鹿角片、仙桃草四味藥組成，方簡(jiǎn)而精，以扶正通絡(luò)為治則，補(bǔ)益脾腎，化瘀通絡(luò)。其中人參為君，固本培元，補(bǔ)脾益氣；鹿角片補(bǔ)益腎陽(yáng)，兼行血消腫，龜板滋腎潛陽(yáng)、養(yǎng)血補(bǔ)心，二者陰陽(yáng)同補(bǔ)，均有強(qiáng)筋健骨之功效，共為臣藥；仙桃草化瘀通絡(luò)止痛為佐藥。四味藥先后天并重，補(bǔ)益脾腎，活血通絡(luò)，去瘀生新?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，人參中有多種化學(xué)成分能夠起到抗氧化、抗衰老作用，比如人參花寡糖可以使多種酶的抗氧化能力增強(qiáng)，人參多糖、人參皂苷能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,減少機(jī)體丙二醛的含量。龜甲可促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的合成，促進(jìn) MSCs(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)向成骨細(xì)胞方向分化[19]。鹿角膠可顯著提高去卵巢大鼠的骨密度、骨礦物質(zhì)含量且成骨細(xì)胞數(shù)增加顯著[20]。仙桃草不僅具有清除體內(nèi)氧自由基的能力[21]，其有效成分槲皮素能夠抑制AGEs與其受體結(jié)合或降低細(xì)胞中AGEs累積[22-23],維持正常的骨穩(wěn)態(tài)。

基于上述理論基礎(chǔ)，結(jié)合本次研究的結(jié)果，筆者認(rèn)為培本固疏方可以提高骨強(qiáng)度，降低骨脆性。其可能是通過(guò)OPG/RANKL/RANK通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成，減緩骨基質(zhì)吸收，還可能是通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力來(lái)防治骨質(zhì)疏松，但具體發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步探討。