電鏡下黃連素液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株的抑制作用及超微結(jié)構(gòu)的影響

胡致愷 葉姝 葉靜靜 陳寧剛

摘要：目的：通過黃連素液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進行的體外抑菌試驗，觀察黃連素液的抑菌效果，并以電鏡觀察細菌超微結(jié)構(gòu)的改變。方法：用醫(yī)院自制的黃連素液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進行處理后，用電鏡觀察細菌超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：電鏡下，經(jīng)黃連素液處理的耐藥菌株菌體分散，部分菌體固縮死亡，而陰性對照組表現(xiàn)為細菌菌體聚集成團，表面光滑，細胞結(jié)構(gòu)完整、胞質(zhì)均勻，可見有絲分裂。結(jié)論：黃連素液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株有較強的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;黃連素;透射電鏡

本研究用黃連素液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進行體外試驗，并采取電鏡來進一步監(jiān)測細菌自身超微特征的變化情況，來觀察黃連素液的抑菌效果，現(xiàn)報道如下：

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃連素液

5%黃連素液為醫(yī)院長期臨床使用的院內(nèi)制劑，250 ?g黃連中藥藥材粉碎加水浸泡2 h，強火加熱至沸，再以文火煎煮至5 000 ml原液，即0.05 g/ml的中藥原液，高壓滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，保質(zhì)期1個月。

1.1.2 試驗菌株

分離自醫(yī)院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染患者的傷口分泌物，經(jīng)Vitek-2 Compact（購自BIOMERIELIX公司）鑒定并經(jīng)平板生長觀察證實為產(chǎn)生物膜的MRSA菌株。將保存的試驗菌株接種于5%血平板，置37℃（ gSP‐9270MBE 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3次。選定質(zhì)控菌株ST-239，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 菌懸液制備

菌種復(fù)蘇，挑取菌落至3%胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soybroth， TBS）液體培養(yǎng)基中，1 30 r/min，37℃勻速振蕩培養(yǎng)過夜，再以1：100比例重新接種至新的TBS中，1 30 r/min，37℃勻速振蕩培養(yǎng)195 min至對數(shù)生長期。取菌液離心，6 000 r/min，15 min，用無菌PBS沖洗兩遍，然后混懸至×109 CFU/ml。

1.2.2 電鏡樣品制備

取約1×107 ml的菌懸液涂布于0.05 g/ml黃連素液的平板表面，置于37℃培養(yǎng)24 h后收集平板上的菌體。用PBS洗滌菌體沉淀3次后，將得到的菌體滴到載玻片上，制成菌懸液涂片。放入電鏡掃描使用的2.5%戊二醛磷酸緩沖液中保持穩(wěn)定3 h;0.1M PBS緩沖液沖洗2次，每次時限為15 min;加入1%鋨酸后固定1 h;0.1M PBS沖洗15min×2次;2%醋酸鈾水溶液染色30 min;50%、70%、90%酒精依次脫水，各15 min×1次;100%酒精脫水20 min×1次;100%丙酮脫水20 min×2次;1：1滲透：無水丙酮與包埋劑按1：1體積混合滲透菌體，并震蕩2 h;純包埋劑滲透菌體，并震蕩2 h;純包埋劑包埋，并置于烘箱內(nèi)聚合，37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h;染色：4%醋酸鈾染色20 min，枸櫞酸鉛染色5 min;將染色后的涂片拍照要求以單孔銅網(wǎng)進行固定，利用電鏡透射進行拍照觀察和記錄。對照組進行空白的菌體，操作步驟相似，可參照實現(xiàn)。

2結(jié)果

兩組MRSA菌株在電鏡下的形態(tài) ? ?空白菌體對照組（不加黃連素液的菌懸液）MRSA菌株菌體透亮，無固縮，聚集成團，偶見正在分裂的菌體。加黃連素液的菌懸液MRSA菌株菌體固縮，不成團。

3討論

黃連作為多年生草本植物，主要來源有三種，分別是毛莨科植物黃連、三角葉黃連或云連，取上述三種中藥曬干得根莖即可，主要成份以小蘗堿為主（超過3.6%）[1～2]。黃連在中藥領(lǐng)域以清熱燥濕、瀉火解毒為主，但是該藥的抗菌譜也較廣，可以對多種細菌產(chǎn)生敏感抗菌作用[3～4]，如金黃色葡萄球菌等，研究發(fā)現(xiàn)對至少高達9種以上的真菌有效果。本研究結(jié)果顯示，在形態(tài)學(xué)上正常的MRSA菌株菌體透亮，無固縮，聚集成團，偶見正在分裂的菌體，增殖活躍;而經(jīng)黃連素液作用后MRSA菌株形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)菌體固縮，不成團，增殖明顯受到抑制，并出現(xiàn)菌體死亡。從而證實：黃連素液確實對MRSA具有抑制作用。

通過電鏡觀察得出黃連素對MRSA有較好的抑菌作用，但具體在何環(huán)節(jié)發(fā)揮藥理作用及其具體的抑菌作用情況尚未確定，需要深入探討，提升中草藥抑菌的現(xiàn)代病理學(xué)理論研究水平。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，化學(xué)工業(yè)出版社，1990.275-276.

[2]王維琪.黃連有效成分的藥理研究與進展[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8（26）：147-148.

[3]姚冬婷，胡駿，張雪清，等.黃連對金黃色葡萄球菌體外抑菌活性的分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2017，32（7）：577-581.

[4]謝川東，文燕，曾昱偉，等.黃連抗菌活性成分研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，57（23）：85-88.