固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留

張 群，吳南村，馬 晨，張 月，劉春華

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海南 海口 571101 ； 2.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101)

一直以來(lái)人們極為重視牛奶中獸藥、抗生素殘留，但我國(guó)對(duì)牛奶中農(nóng)藥殘留的關(guān)注不夠。我國(guó)未制定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量[1]，歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定了牛奶中氯氟氰菊酯的最大殘留限量分別為0.02 mg/kg[2]和0.2 mg/kg[3]； 歐盟和CAC均規(guī)定了牛奶中氯氰菊酯的最大殘留限量為0.05 mg/kg[4-5]。有報(bào)道指出,牛奶中檢出氯氟氰菊酯(0.11～0.21 mg/kg)和氯氰菊酯(0.21～0.34 mg/kg)[6]，超過(guò)歐盟和CAC標(biāo)準(zhǔn)。氯氟氰菊酯和氯氰菊酯作為擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥，這類農(nóng)藥的毒性一般不大，但有蓄積作用，會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生長(zhǎng)期、微劑量、慢性毒性作用[7-8]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已做了很多這類農(nóng)藥的分析方法探索：氣相色譜法[9-12]和氣相色譜-質(zhì)譜法[13-15]、高效液相色譜測(cè)定[16-19]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[20-22]等。上述報(bào)道主要是標(biāo)準(zhǔn)品或者果蔬、茶、魚(yú)等基質(zhì)的測(cè)定，有關(guān)牛奶中這2種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道較少。本文建立了牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的固相萃取凈化-氣相色譜質(zhì)譜(Solid phase extraction-gas chromatography coupled to mass spectrometry，SPE-GC-MS)檢測(cè)方法，為監(jiān)管監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 7000三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)，Agilent公司)；EB-280-12電子頂載天平(日本，島津公司)；T25 basic高速勻漿機(jī)(廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)；QL-901旋渦混合器(江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠)；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；C18固相萃取柱(CNW Technologies GmbH，2000 mg/10 mL)；毛細(xì)管氣相色譜柱SLB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)SUPELCO公司)。

新鮮牛奶，購(gòu)于新疆市場(chǎng)。氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%(天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心)。乙腈、丙酮、正己烷(HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 牛奶鮮樣500 mL，裝入潔凈的密封罐中，于-18 ℃編號(hào)保存。稱取15.00 g牛奶樣品，樣品中加入20 mL乙腈以及4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉；于振蕩器上劇烈振蕩10 min，在4 200 r/min條件下離心8 min；收集上清液置于另一個(gè)100 mL雞心瓶中；繼續(xù)向殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，離心；合并2次提取液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，待凈化。將待凈化溶液轉(zhuǎn)移到用10 mL乙腈活化的C18固相萃取柱中，用5 mL乙腈洗滌2次樣品瓶，洗滌樣品瓶，洗滌液并入固相萃取柱中；收集全部流出液于100 mL雞心瓶中；用10 mL乙腈洗脫固相萃取柱；合并流出液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL左右；用5 mL正己烷進(jìn)行溶劑交換，重復(fù)操作2次，將收集液旋蒸近干，氮?dú)獯蹈珊?，最后定容用正己烷?/p>

1.2.2 氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)條件 氣相(GC)條件：程序升溫，初始溫度80 ℃,以35 ℃/min升溫至220 ℃,以25 ℃/min升溫至250 ℃,以4 ℃/min升溫至280 ℃,保持2.3 min;總運(yùn)行時(shí)間：15.0 min;流速：1.0 mL/min；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

SIM條件：電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：230 ℃；GC-MS接口溫度：280 ℃，選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)條件見(jiàn)表1。

表1 SIM模式下待測(cè)農(nóng)藥的檢測(cè)條件Table 1 Detection conditions for tested pesticides in SIM mode

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：氯氟氰菊酯和氯氰菊酯用正己烷配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃保存。

基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)品的配制：參照樣品前處理方法將空白的樣品(未有氯氟氰菊酯和氯氰菊酯檢出牛奶樣品為空白樣品)配制成基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋制成所需的定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定 稱取4組經(jīng)測(cè)定不含2種農(nóng)藥的空白牛奶樣品，每組5個(gè)重復(fù)。在空白樣品中分別添加氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加水平為0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg，按照所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 考察了丙酮、乙腈和正己烷作為溶劑提取的效果，結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度為0.1 mg/kg時(shí)，提取劑為乙腈時(shí),2種農(nóng)藥的樣品回收率比較好，故選用乙腈為提取劑(見(jiàn)圖1)。

圖1 提取劑對(duì)2種農(nóng)藥的提取效果(n=5)Fig.1 Extraction effect of extraction agent on 2 pesticides

2.1.2 固相萃取柱的優(yōu)化 2種農(nóng)藥在3種固相萃取柱[石墨化炭黑(Cabon-GCB)、弗羅里硅土(Florisil)和C18]上均有相當(dāng)?shù)谋Ａ粜袨?，但C18固相萃取柱的回收率較前兩者略高，且重復(fù)性好。因此本方法選C18固相萃取柱凈化。

2.2 待測(cè)農(nóng)藥定量和定性離子的選擇 首先，在m/z0～450之間分別對(duì)2種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00 mg/L)進(jìn)行全掃描，確定其保留時(shí)間(見(jiàn)表1)和質(zhì)譜圖。在質(zhì)譜圖中，選擇特征性、質(zhì)量數(shù)和對(duì)稱性最高，同時(shí)重現(xiàn)性好且不與柱流失碎片離子相同的離子為定量離子。此外，另選擇2個(gè)特征性、質(zhì)量數(shù)和對(duì)稱性較高的離子為定性離子。圖2為空白樣品、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和添加樣品在表1條件下得到的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)總離子流圖，從圖2中可以看出，2種農(nóng)藥所得到的譜峰峰形尖銳，對(duì)稱性好，各譜峰間完全分離。

2.3 線性方程、定量限、回收率和精密度

2.3.1 線性方程 按1.2.3所述配制的0.01～1.00 mg/kg內(nèi)5個(gè)梯度濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，濃度分別為：0.01、0.05、0.1、0.2 mg/L和1 mg/L。在1.2.2的檢測(cè)條件下，以進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性方程(表2)。結(jié)果表明，在0.01～1 mg/L范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2>0.99。

2.3.2 定量限 依照3倍信噪比(S/N)對(duì)牛奶中2種農(nóng)藥的檢出限(LOD)進(jìn)行計(jì)算，確定為9×10-5mg/L；再依據(jù)10倍信噪比確定其定量限(LOQ)為3×10-4mg/L。通過(guò)實(shí)際添加回收試驗(yàn)，最終確定牛奶中氯氟氰菊酯的定量限為0.005 mg/L，氯氰菊酯的定量限為0.01 mg/L，此時(shí)5次試驗(yàn)的平均回收率分別為87.3%和92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為8.2%和3.5%。

2.3.3 回收率和精密度 根據(jù)牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量值以及方法的靈敏度，對(duì)牛奶樣品設(shè)定了0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.2 mg/kg四個(gè)濃度的添加水平，牛奶中的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。在0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg四個(gè)添加水平下，氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留的平均回收率在83.1%～102.8%；5次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.4%～9.1%，均滿足定量分析要求。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè) 應(yīng)用此方法對(duì)市場(chǎng)銷售的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，選購(gòu)的15份樣品中均未檢出這2種農(nóng)藥殘留。

3 討論

牛奶中脂肪、蛋白質(zhì)含量較高，基質(zhì)復(fù)雜[23]，要對(duì)牛奶中的農(nóng)殘進(jìn)行提取，然后凈化樣品有效的提取目標(biāo)物?，F(xiàn)有文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)中常用丙酮、乙腈和正己烷等作為提取劑提取動(dòng)植物中的農(nóng)藥殘留[1,9-10,19-20]，本試驗(yàn)考察了丙酮、乙腈和正己烷作為溶劑提取的效果，發(fā)現(xiàn)提取劑為乙腈時(shí)2種農(nóng)藥的添加回收率比較好，選擇乙腈為提取劑。這一結(jié)果可能是乙腈與水部分互溶，加入氯化鈉后，鹽析、分層和除雜效果明顯。然后，考察了擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的3種固相萃取柱[24-28]-石墨化炭黑(Carbon-GCB)、弗羅里硅土(Florisil)和C18的凈化效果，2種農(nóng)藥在3種固相萃取柱上均有相當(dāng)?shù)谋Ａ粜袨?，但C18固相萃取柱的回收率較前兩者略高，且重現(xiàn)性好，本方法選擇C18固相萃取柱凈化。這可能歸功于以硅膠為基質(zhì)的反相C18萃取柱強(qiáng)疏水性選擇性，適用于從水性樣本中保留大多數(shù)有機(jī)化合物，同時(shí)其具有高鍵合密度，低流失，高回收率等特點(diǎn)，可以更有效地去除牛奶中脂肪和脂類等干擾物影響而保留目標(biāo)物得到更高的回收率，且重現(xiàn)性好。

GC-MS的全掃描模式，由于掃描范圍寬、頻率低，導(dǎo)致背景值基線較高，會(huì)影響目標(biāo)農(nóng)藥的靈敏度。本方法采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式，可以有針對(duì)性地選擇目標(biāo)化合物的特征離子監(jiān)測(cè)，提高了方法的靈敏度，降低了干擾，每種化合物選擇3個(gè)特征離子，根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)特征離子的豐度比，可對(duì)樣品中存在的目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行定性，可排除在復(fù)雜基質(zhì)中與農(nóng)藥化合物保留時(shí)間一致而不是農(nóng)藥的化合物的假陽(yáng)性結(jié)果。如果測(cè)定樣品檢出的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致，并在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致(相對(duì)豐度> 50%，允許± 10%偏差;相對(duì)豐度>20%～ 50%，允許±15%偏差；相對(duì)豐度> 10%～20%，允許±20%偏差；相對(duì)豐度≤10%,允許±50%偏差)，則可判斷樣品中存在這種農(nóng)藥[29]。García-Rodríguez等利用固相微萃取(SPME)方法結(jié)合GC-MS測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖海水樣本中的有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥，該方法具有良好的線性度、精度和較低的LODs[15]。楊麗莉等采用C18固相萃取柱富集環(huán)境水中六六六、滴滴涕和環(huán)氧七氯，用少量有機(jī)溶劑洗脫，添加內(nèi)標(biāo)后利用GC-MS的SIM模式進(jìn)行目標(biāo)農(nóng)藥的定性、定量，干擾小，測(cè)定靈敏度高[30]。本方法定量選擇一個(gè)干擾小、特征性高的離子，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法通過(guò)工作站進(jìn)行，結(jié)果同樣表明，線性響應(yīng)和精密度良好，準(zhǔn)確度和靈敏度高。

表2 2種農(nóng)藥的線性方程及決定系數(shù)Table 2 Linear equations,determination coefficient and linear ranges of the two pesticides

表3 2種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Average recovereries and relative standard deviations (RSDs) of the two pesticides (%,n=5)

長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛奶中獸藥殘留研究較多，特別是抗生素，牛奶中農(nóng)藥殘留的研究較少。國(guó)內(nèi)外毒理學(xué)研究專家研究表明，牛奶中農(nóng)藥殘留污染對(duì)人體健康存在微劑量、慢性毒性[7-8,31]。本試驗(yàn)建立了C18固相萃取柱凈化的氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留的檢測(cè)方法，樣品前處理簡(jiǎn)便快速且回收率高，能夠較好地排除基質(zhì)干擾；定量限及精密度均能滿足痕量分析的要求，而且可以滿足歐盟等國(guó)牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量的檢測(cè)要求，為其在畜禽養(yǎng)殖中違禁使用的監(jiān)管監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，保障人類健康，回避潛在食用風(fēng)險(xiǎn)。