SWELL1真核表達載體的構(gòu)建及其在哺乳動物細胞的表達

夏忠雪，王 勝，周雁紅，林小珍，姜曉明，丁 旭，聶文營，郝 峰

(1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013 ； 2.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130021 ； 3.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013)

容積調(diào)控性陰離子通道(Volume-regulated anion channels, VRAC)普遍存在于哺乳動物細胞，參與多種生命活動，如調(diào)節(jié)細胞容積動態(tài)平衡、維持細胞自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、輔助運輸代謝物或藥物和細胞外信號轉(zhuǎn)導，與細胞的電生理、細胞增殖與分化以及細胞的凋亡等多種生命活動密切相關(guān)[1]。且與腫瘤、心肌缺血、心律失常等多種疾病的發(fā)生存在必然的聯(lián)系[2-4]。2014年《科學》和《細胞》雜志分別發(fā)表文章證實SWELL1是容積調(diào)控氯離子通道的重要組成部分，為深入研究容積調(diào)控性氯離子通道提供了便利條件。但是，目前對于SWELL1容積調(diào)控性氯離子通道的認識尚存在局限性[5-7]。

本試驗構(gòu)建SWLL1真核表達載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，觀察SWELL1容積調(diào)控性氯離子通道在多種哺乳動物細胞的表達情況(如：FRT、HEK293、CHO等)，熒光淬滅動力學試驗檢測SWELL1的功能，獲得用于研究SWELL1的最佳細胞模型。本試驗結(jié)果為研究SWELL1生理特性，以及后續(xù)篩選SWELL1調(diào)節(jié)劑、發(fā)現(xiàn)SWELL1關(guān)鍵堿基和氨基酸、研究SWELL1與某些生理活動和病理機制的內(nèi)在聯(lián)系等，提供了重要的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 真核表達載體pCMV3-RFP由中國科學院關(guān)新剛教授饋贈，YFP-H148Q /I152L真核表達載體由本實驗室前期構(gòu)建，所用引物由南京諾唯贊公司合成。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，購自Invitrogen公司；同源重組酶，購自南京諾唯贊公司；尼氟滅酸(Niflumic acid，NFA)，購自Sigma公司；F-12Ham′s營養(yǎng)培養(yǎng)基，購自Sigma公司；Hygromycin B和G418抗生素，購自Invitrogen公司；血清，購自Gibco公司；FRT、HEK293、CHO細胞由本實驗室保存。

1.2 主要儀器 Fluo star多功能酶標儀(德國BMG公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超純水機(美國Millipore公司)；凝膠成像儀(美國Biorad公司)；PCR儀(美國ABI公司)；Nanodrop 2000(美國Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 SWELL1真核表達載體的構(gòu)建和鑒定 UniGene數(shù)據(jù)庫查詢SWELL1在人體多種組織細胞中的表達情況，并選取表達量最高的SJSA1軟骨肉瘤細胞作為目的基因SWELL1的來源。取密度90%SJSA1細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的純度；GenBank數(shù)據(jù)庫查詢ID為NM_019594.3的SWELL1序列編碼區(qū)全長，南京諾唯贊公司CE Design軟件設計引物，下游引物去除終止密碼子，使其C端的ORF表達，上游引物:5′- TTCGAACCACCGCCGGGGATGATTCCGGTGACAGAGCT-3′，下游引物:5′-GGCCTGCTCCTTGTCAGCTGCAAGAGTCACGATAG-3′；參照試劑盒說明書以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收；EcoRⅤ和NheⅠ雙酶切獲得帶有同源臂的線性載體；同源重組酶連接回收產(chǎn)物與載體；重組質(zhì)粒導入DH5α大腸桿菌感受態(tài)，涂布含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板中，次日挑取陽性單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，測序鑒定。

1.3.2 穩(wěn)定表達SWELL1和YFP-H148Q/I152L細胞株的建立 按照Lipofectamine 2000 Reagent說明書將SWELL1分別轉(zhuǎn)入FRT、HEK293、CHO細胞，Hygromycin B抗生素篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下細胞膜可見紅色熒光的細胞克隆(FRT細胞)，有限稀釋后保存陽性細胞株，連續(xù)傳代3次仍有百分之百細胞膜上可見紅色熒光的FRT細胞為穩(wěn)定表達SWELL1的陽性細胞株，擴大培養(yǎng)。將YFP-H148Q/I152轉(zhuǎn)入已表達SWELL1的FRT細胞，用G418抗生素篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下胞漿可見綠色熒光信號的FRT細胞克隆，具體步驟同上，獲得SWELL1和YFP-H148Q/I152L共表達的FRT細胞株。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定SWELL1 mRNA的表達 選取穩(wěn)定表達SWELL1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株，棄去培養(yǎng)液, 加入 TRIzol，按照試劑盒說明書提取總RNA，以總RNA為模板合成cDNA。取此cDNA為模板， 以SWELL1編碼區(qū)特異性引物PCR擴增目的片段；上游引物：5′-CTGAACCGCAACAAGATCGA-3′，下游引物：3′-CGCCCACCCTGGAGGGC-5′；對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序鑒定。

1.3.4 鹵族元素敏感的YFP-H148Q /I152L熒光淬滅動力學試驗 選取傳代2次后狀態(tài)較好的共表達SWELL1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株，傳代到96孔板，用PBS清洗3遍去除雜質(zhì)，PBS全部吸出后，進行2組試驗：第1組加入50 μL超純水，隔2 s由酶標儀注入碘離子的PBS緩沖液，記錄相對熒光強度；第2組加入50 μL含300 μmol/L的NFA抑制劑，孵育10 min后全部吸出，加入50 μL超純水，隔2 s由酶標儀注入碘離子的PBS緩沖液，記錄相對熒光強度。具體設置如下:激發(fā)光波長500 nm，發(fā)射光波長540 nm。以每秒5個點的速度動態(tài)檢測相對熒光強度，其中前2 s為基線，2 s后以280 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL碘離子PBS緩沖液。500 mL 137 mmol/L NaI PBS緩沖液的配方如下：137 mmol/L NaI 10.27 g、2.7 mmol/L KCl 0.1 g、1.0 mmol/L CaCl20.055 g、0.5 mmol/L MgCl20.051 g、8.1 mmol/L Na2HPO40.575 g、1.5 mmol/L KH2PO40.102 g。

2 結(jié)果

2.1 SWELL1真核表達載體的構(gòu)建 UniGene數(shù)據(jù)庫獲得SWELL1容積調(diào)控性氯離子通道在人體腫瘤組織的最佳表達量為軟骨肉瘤細胞(表1)；挑選陽性克隆送公司測序，部分測序結(jié)果如中插彩版圖1，測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫獲得的SWELL1序列比對完全一致，比對結(jié)果略。結(jié)果表明成功構(gòu)建SWELL1真核表達載體。

表1 SWELL1在人體的多種組織細胞中的表達Table 1 The expression of SWELL1 in various human tissue and cells

2.2 細胞模型的構(gòu)建 倒置熒光顯微鏡下觀察，可見FRT細胞膜上有清晰的紅色熒光(見中插彩版圖2)，表明SWELL1表達于FRT細胞膜。CHO和HEK293胞漿有紅色熒光，表明SWELL1表達在CHO和HEK293細胞胞漿。結(jié)果證實，SWELL1可清晰表達于FRT細胞膜，F(xiàn)RT細胞是一種用來表達SWELL1以利于后續(xù)深入研究其功能的良好細胞模型。

2.3 細胞模型表達SWELL1的檢測 反轉(zhuǎn)錄PCR電泳結(jié)果顯示，在 250 bp 附近出現(xiàn)特異性條帶，與預期的目的片段大小相符(中插彩版圖3A)；并對PCR產(chǎn)物切膠回收后測序，部分測序結(jié)果見中插彩版圖3B，測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫獲得的SWELL1序列比對，比對結(jié)果表明，F(xiàn)RT細胞在mRNA水平表達SWELL1，SWELL1目的基因成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至FRT細胞。

2.4 SWELL1轉(zhuǎn)運陰離子的試驗 多功能酶標儀熒光淬滅動力學試驗結(jié)果顯示(圖4)，用低滲溶液作用SWELL1后，隨著NaI緩沖液的加入相對熒光強度顯著性下降，提示SWELL1開放，碘離子內(nèi)流。而加入抑制劑NFA后，相對熒光強度無顯著性變化，提示SWELL1陰離子通道不開放。結(jié)果表明，SWELL1容積調(diào)控性氯離子通道具有轉(zhuǎn)運碘離子的功能，且轉(zhuǎn)運陰離子的功能可被氯離子通道抑制劑所抑制。

圖4 熒光淬滅動力學試驗鑒定SWELL1的功能Fig.4 The results of fluorescence quenching kinetic experiments identify SWELL1 functionsA: 低滲狀態(tài)下相對熒光強度的變化； B: 氯離子通道抑制劑NFA對SWELL1離子轉(zhuǎn)運功能的影響A:The result of relative fluorescence intensity in low osmotic pressure; B:The effect of chloride channel inhibitor NFA on SWELL1 ion transport function

3 討論

陰離子通道根據(jù)其門控機制分為電壓門控陰離子通道、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子、鈣離子激活陰離子通道、配體激活的陰離子通道和容積調(diào)控性陰離子通道[8-9]。相對其他陰離子通道而言，對容積調(diào)控性氯離子通道的認知尚有不足。2014年《科學》和《細胞》雜志分別證實SWELL1是容積調(diào)控氯離子通道的重要組成元件，為深入研究容積調(diào)控性氯離子通道提供了不容忽視的幫助[5-7]。SWELL 1是體積調(diào)節(jié)陰離子通道(VRAC)的必需亞基，調(diào)節(jié)細胞的體積平衡，并被低滲溶液激活[10]。SWELL 1與其他4位家族成員一起，可能形成一組具有不同性質(zhì)的VRAC通道，但SWELL 1本身也具有功能[11]。

本試驗通過同源重組成功構(gòu)建SWELL1真核表達載體，利用可靈敏特異反映其開放情況的YFP-H148Q/I152L進行熒光淬滅動力學試驗尋找一種較好的可表達SWELL1的細胞，并利用該細胞鑒定SWELL1的功能。有研究證實，YFP-H148Q/I152L是一種黃色熒光蛋白的突變體，對于碘離子的具有極高的敏感性，微量的碘離子就可使其熒光迅速發(fā)生淬滅，通過Fluostar多功能酶標儀可快速準確的反應其相對熒光強度[12-13]。本試驗結(jié)果表明：SWELL1表達于FRT細胞膜，是一種比較適合用于表達SWELL1的細胞；FRT細胞貼壁較緊，利于熒光淬滅動力學試驗的進行；低滲狀態(tài)下，熒光信號發(fā)生淬滅，證實SWELL1容積調(diào)控性氯離子通道具有轉(zhuǎn)運陰離子(如碘離子)的功能；SWELL1是容積調(diào)控性陰離子通道不可或缺的一部分，本試驗獲得的模型可敏感地反映SWELL1容積調(diào)控性陰離子通道的開放情況，可反復傳代，具有傳統(tǒng)電生理技術(shù)不可比擬的優(yōu)點，且通過熒光淬滅動力學試驗證實了SWELL1是容積調(diào)控氯離子通道的編碼基因，為后續(xù)SWELL1調(diào)節(jié)劑篩選、SWELL1關(guān)鍵堿基和氨基酸的發(fā)現(xiàn)、SWELL1與某些生理活動和病理機制的內(nèi)在聯(lián)系等研究奠定了良好基礎。