2株膠東地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒分離株的致病性試驗(yàn)

董振杰 , 劉 東 , 魏建平 , 佘銳萍

[1.福喜(威海)農(nóng)牧發(fā)展有限公司 , 山東 威海 452600 ； 2.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266000 ； 3.大連成三牧業(yè)股份有限公司，遼寧 大連 116300 ； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193]

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，有12個(gè)血清型，其中FAdV-8b血清型可引起雞包涵體肝炎(IBH)， FAdV-4血清型可引起雞心包積水綜合征(HHS)[1]。近年來(lái)，這2種疾病在世界各地(例如美國(guó)[2]、韓國(guó)[3]、日本[4]和中國(guó)[5])均有暴發(fā)，已經(jīng)對(duì)肉雞和肉種雞的養(yǎng)殖造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2013年，膠東地區(qū)發(fā)現(xiàn)了1例包涵體肝炎的病例，導(dǎo)致10～15日齡商品代雛雞出現(xiàn)死亡，死亡率約為2%～10%；2015年，膠東地區(qū)發(fā)現(xiàn)了1例雞心包積水綜合征的病例，導(dǎo)致31周齡的肉種雞出現(xiàn)死亡，死亡率為14.05%。采集上述2個(gè)病例的肝臟樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，發(fā)現(xiàn)病原分別為FAdV-8b和FAdV-4，分別命名為FXWH-8b株和FXWH-4株。

以2株分離株為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)15日齡SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)病毒的毒力和致病性進(jìn)行研究，旨在明確FXWH-8b株和FXWH-4株感染發(fā)病后的臨床癥狀、剖檢病變、病理組織學(xué)變化及病毒在各組織器官的分布情況，為闡明FXWH-8b株和FXWH-4株的致病機(jī)理及防制提供理論依據(jù)。

1 材料

15日齡SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；稀釋復(fù)壯后(TCID50108.0)FXWH-8b株和FXWH-4株的病毒液各10 mL，來(lái)自青島易邦生物工程有限公司；TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)、蛋白酶K，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醛、梯度乙醇和二甲苯(級(jí)別為化學(xué)純)、伊紅染液、蘇木素染色液，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；FAdV單抗(3D7)，購(gòu)自國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心。

2 方法

2.1 攻毒試驗(yàn) 60只15日齡的SPF雛雞隨機(jī)分成3組，每組20只。分別為FXWH-8b株攻毒組、FXWH-4株攻毒組、空白對(duì)照組。通過(guò)腿部肌肉注射接種，攻毒組病毒注射劑量均為0.2 mL/只，對(duì)照組每只注射0.2 mL生理鹽水。各組雞只分別飼養(yǎng)在不同的隔離器中，逐日觀察癥狀并記錄，觀察期為3 d。觀察完成后，所有雞只安樂(lè)死。

對(duì)各組雞只進(jìn)行剖檢觀察，并做好記錄，采取各組雞只的腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、十二指腸、空腸、盲腸、法氏囊、腺胃、胰腺、胸腺、氣管等組織，凍存，作為PCR檢測(cè)的樣品；另取各組3～4只發(fā)病的活雞和死雞的上述組織，用10%的中性甲醛溶液固定24 h。

2.2 病理組織學(xué)觀察 采用常規(guī)石蠟切片的方法制作切片，通過(guò)蘇木精-伊紅(H.E.)染色，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病變并記錄。

2.3 PCR檢測(cè) 用Meulemans G發(fā)表的通用引物，檢測(cè)病毒在各組織中的分布情況。

2.4 免疫組化分析 用常規(guī)免疫組化方法進(jìn)行試驗(yàn)，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀 FXWH-8b株攻毒組：攻毒24 h后，有5只雞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，頭部皮膚及眼部發(fā)紺，排出黃綠色稀糞，畏寒怕冷，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍甚至無(wú)反應(yīng)；72 h后，有8只雞死亡，剩余的12只雞均出現(xiàn)明顯臨床癥狀。FXWH-4株攻毒組：攻毒24 h 后，有12只雞開(kāi)始出現(xiàn)明顯臨床癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，頭及眼部發(fā)紺，排出黃綠色稀糞，畏寒怕冷，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍甚至無(wú)反應(yīng)；48 h后20只雞全部死亡。對(duì)照組：在72 h 內(nèi)無(wú)任何明顯臨床癥狀。

3.2 剖檢變化 FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒后剖檢病理變化見(jiàn)表1。

表1 分離株攻毒后剖檢病理變化Table 1 Pathological changes of the isolates after virus challenge

3.3 病理組織學(xué)觀察 FXWH-8b株攻毒72 h后，死雞和活雞病理組織學(xué)觀察均顯示肝臟細(xì)胞呈彌散性脂肪變性(見(jiàn)中插彩版圖1)，可見(jiàn)灶性壞死，核內(nèi)包涵體不明確；脾臟髓竇內(nèi)含鐵血黃素沉淀；肺臟嚴(yán)重淤血；腎臟出血，腎小管上皮細(xì)胞脫落；十二指腸黏膜上皮細(xì)胞輕微脫落；空腸黏膜上皮細(xì)胞輕微脫落；盲腸黏膜上皮細(xì)胞輕微脫落；腺胃黏膜上皮細(xì)胞輕微脫落；法氏囊淋巴濾泡內(nèi)少量淋巴細(xì)胞遺失。

FXWH-4株攻毒48 h后，死雞的病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，肝臟病變同上(見(jiàn)中插彩版圖1)；脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞遺失；肺臟嚴(yán)重淤血；腎臟腎小管上皮細(xì)胞脫落；十二指腸黏膜上皮細(xì)胞脫落；空腸黏膜上皮細(xì)胞脫落；盲腸、腺胃黏膜上皮細(xì)胞壞死，固有層淤血；法氏囊黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落、淋巴濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞遺失。

空白對(duì)照組注射生理鹽水72 h后，活雞病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，在肝臟、肺臟、腺胃和盲腸有輕微的組織病理學(xué)變化。

3.3 PCR檢測(cè) FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒組SPF雞的腦、胸腺、氣管、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腺胃、胰腺、十二指腸、空腸、盲腸和法氏囊組織樣品中，病毒PCR檢測(cè)均呈陽(yáng)性；其中，在雞的肝臟、肺臟、腎臟、腺胃、空腸和盲腸樣品中的PCR檢測(cè)陽(yáng)性率均為100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 免疫組化分析 FXWH-8b株病毒抗原僅在肝臟組織樣品中檢測(cè)呈陽(yáng)性；FXWH-4株病毒抗原在肝臟、腎臟、十二指腸和空腸組織樣品中檢測(cè)均呈陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度是：肝臟>十二指腸>空腸和腎臟。對(duì)照組樣品檢測(cè)均呈陰性。結(jié)果見(jiàn)表3、中插彩版圖2。

表2 組織中的病毒DNA PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR results of virus DNA in tissues (只)

表3 免疫組化染色結(jié)果Table 3 Immunohistochemical staining results

4 討論

臨床癥狀觀察顯示，F(xiàn)XWH-8b株和FXWH-4株均能在攻毒后48 h內(nèi)引起15日齡的SPF試驗(yàn)雞發(fā)病，呈現(xiàn)較明顯的臨床癥狀。FXWH-8b株攻毒后48 h沒(méi)有雞只死亡，72 h時(shí)引起40%的試驗(yàn)雞死亡；FXWH-4株在48 h引起100%的試驗(yàn)雞死亡。這可能是由于病毒以注射方式感染時(shí)，毒株會(huì)表現(xiàn)很強(qiáng)的致病性，短時(shí)間內(nèi)造成機(jī)體損傷乃至死亡，呈現(xiàn)急性感染死亡的癥狀[1]；另一個(gè)原因可能是攻毒劑量過(guò)大，故建議其他研究者將感染途徑改為以滴口方式通過(guò)消化道感染，攻毒劑量應(yīng)多次預(yù)試驗(yàn)后確定。從死亡率來(lái)看，2株分離株的毒力都比較強(qiáng)，但是FXWH-4株的毒力遠(yuǎn)強(qiáng)于FXWH-8b株，這與劉東等[7]研究認(rèn)為血清型FAdV-4毒力較強(qiáng)，本身能引起易感雞群的發(fā)病的結(jié)論一致。

病理組織觀察結(jié)果顯示，在2株Ⅰ群禽腺病毒分離株攻毒后雞的組織切片中，均未觀察到核內(nèi)包涵體的存在，其原因可能是由于FXWH-4株在攻毒后48 h雞只全部死亡，F(xiàn)XWH-8b株攻毒后72 h活雞均已安樂(lè)死處理，導(dǎo)致病毒沒(méi)有充足的時(shí)間作用于活體細(xì)胞，因而未形成核內(nèi)包涵體。這與國(guó)紀(jì)壘等[8]報(bào)道的血清10型腺病毒在人工感染SPF雞只第5天在肝臟內(nèi)出現(xiàn)少量嗜堿性的核內(nèi)包涵體一致。該結(jié)果表明以后關(guān)于Ⅰ群禽腺病毒的核內(nèi)包涵體的研究至少需要觀察到攻毒后5 d。

病毒分布檢測(cè)結(jié)果顯示，2株分離株無(wú)論是在死雞還是活雞的肝臟、肺臟、腎臟、腺胃、空腸和盲腸樣品中檢出率均為100%，說(shuō)明2株分離株在攻毒后均較快在多組織器官定植，這些器官均是2株毒株的靶器官。此試驗(yàn)結(jié)果與趙靜研究的包涵體肝炎在肝臟和盲腸的檢出率較高是一致的。與國(guó)紀(jì)壘等[8]研究的血清10型感染1日齡SPF雞的結(jié)果：肝臟、脾臟和腸道是病毒侵害的主要靶器官是一致的。故這些器官可以作為此病毒分離鑒定的采樣器官。

免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株病毒抗原廣泛存在于肝臟細(xì)胞中，與趙靜等[9]研究結(jié)果一致，但FXWH-4株在腎臟、十二指腸和空腸組織內(nèi)也有病毒抗原存在，說(shuō)明不同的病毒株有不同的嗜組織性。

綜上所述，2株膠東地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒分離株FXWH-8b株和FXWH-4株均有較強(qiáng)的毒力和致病性，可侵害多個(gè)雞只組織和器官。