棘孢木霉(Trichoderma asperellum)產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的特性

王恒震，李化強(qiáng)，吳菲菲，陳瓊，張?jiān)缑鳎瑒c

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院, 湖南 邵陽(yáng)，422000)

果膠是存在于高等植物的原代細(xì)胞壁和中間薄片中的多糖，主要由線(xiàn)性骨架組成，主要成分是部分甲酯化的α-1,4-D-聚半乳糖醛酸[1-2]。降解柑橘囊衣所用到的酶有果膠酶和纖維素酶[3]，聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶的一類(lèi)，聚半乳糖醛酸酶的應(yīng)用十分廣泛，現(xiàn)已應(yīng)用于食品、飼料、廢水處理、造紙、紡織等行業(yè)[4]；在食品加工工業(yè)中，廣泛應(yīng)用在果蔬汁的加工、果酒釀造、去除果皮等行業(yè)[5-6]。食品加工生產(chǎn)過(guò)程中使用的聚半乳糖醛酸酶往往是通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的，隨著果蔬行業(yè)的快速發(fā)展以及環(huán)保的推進(jìn)，果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開(kāi)發(fā)成為工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)，對(duì)于任何一種酶制劑來(lái)說(shuō)都需要探究酶學(xué)性質(zhì)，才能發(fā)揮酶最大的使用價(jià)值。在前期的研究過(guò)程中課題組從臍橙果園土壤中篩選出了1株棘孢木霉[7-8]，相關(guān)的報(bào)道也說(shuō)明棘孢木霉可應(yīng)用到食品領(lǐng)域[9-10]，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)它可以產(chǎn)出降解柑橘囊衣的酶，因此分析該菌種可能既產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶又產(chǎn)纖維素酶，而木霉菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的研究幾乎沒(méi)有，該菌種產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶對(duì)于降解柑橘囊衣的效果顯著，研究該酶的特性可以促進(jìn)果蔬行業(yè)的改革，減少環(huán)境的壓力，具有重要意義。

本文研究聚半乳糖醛酸酶的特性，對(duì)該酶進(jìn)行部分純化并研究其理化特性、分子質(zhì)量大小以及動(dòng)力學(xué)等酶學(xué)性質(zhì)，以期為果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

棘孢木霉菌(Trichodermaasperelham)(14 636)，本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

橘粉培養(yǎng)基(g/L)：橘皮粉9.12,NH4NO36.42、(NH4)2SO42.14、MgSO40.60、NaCl 1.00，KH2PO41.00，K2HPO41.00，去離子水1 000 mL[5]。

1.1.3 主要試劑

果膠，阿拉丁試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，生工生物工程股份有限公司；D-半乳糖醛酸，Sigma；海藻酸鈉、戊二醛、CaCl2、酒石酸鉀鈉等,永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

UV2900紫外分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SB-5200超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HZ85-2型磁力攪拌機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚半乳糖醛酸酶粗酶液制備

將篩選活化的棘孢木霉于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱下培養(yǎng)72 h，經(jīng)過(guò)3800 r/min離心20 min后過(guò)0.22 μm濾膜后得粗酶液。

1.2.2 聚半乳糖醛酸酶活性的測(cè)定

(1)酶活測(cè)定：通過(guò)二硝基水楊酸法[11-12]測(cè)定聚半乳糖醛酸酶活性。聚半乳糖醛酸酶活力計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1,試驗(yàn)組 OD 值所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上還原糖量；A2,對(duì)照組 OD 值所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上還原糖量；N,酶液稀釋倍數(shù)；3,測(cè)定酶活力時(shí)取了反應(yīng)液的1/3；t,反應(yīng)所需時(shí)間,h。

相對(duì)酶活計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

(2)蛋白含量測(cè)定：蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G250 法，并且以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品[13]。

1.2.3 聚半乳糖醛酸酶的純化

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)

以低分子質(zhì)量蛋白Marker為標(biāo)記，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定聚半乳糖醛酸酶的分子質(zhì)量。另外用含有質(zhì)量濃度2.5 g/L果膠的凝膠進(jìn)行聚半乳糖醛酸酶活性檢測(cè)，用質(zhì)量濃度2 g/L的釕紅作為染液[15]。

1.2.5 溫度對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

將聚半乳糖醛酸酶置于30～70 ℃的環(huán)境中，測(cè)定最佳反應(yīng)溫度，通過(guò)在30～70 ℃下水浴保溫1 h測(cè)定酶活，以確定聚半乳糖醛酸酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.6 pH對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

將聚半乳糖醛酸酶置于pH 3～8的緩沖溶液中，以測(cè)定最佳反應(yīng)pH，通過(guò)在pH 3～8的緩沖溶液中水浴保溫1 h測(cè)定酶活，以確定聚半乳糖醛酸酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.7 緩沖液對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響

通過(guò)在pH 4.8和離子強(qiáng)度(50.0 mmol/L)恒定的乙酸乙酸鈉緩沖液、檸檬酸緩沖液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中分別進(jìn)行該酶活性測(cè)定，研究了不同緩沖液對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響。

1.2.8 聚半乳糖醛酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

通過(guò)在1～20 g/L不同底物質(zhì)量濃度、48 ℃和pH 4.8的條件下，測(cè)定了聚半乳糖醛酸酶的米氏常數(shù)(Km)和最大速度(Vmax)。用Lineweavereburk圖(1/[S]對(duì)1/[V])計(jì)算了聚半乳糖醛酸酶的Km值和Vmax值，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.2.9 底物特異性

在不同底物(包括果膠、木聚糖和羧甲基纖維素)的質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液中測(cè)定了聚環(huán)化酶的底物特異性。

1.2.10 金屬離子和表面活性劑對(duì)聚半乳糖酶活性的影響

在濃度為1 mmol/L金屬離子(1∶1)條件下，測(cè)定不同金屬離子(Co2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Li2+和Fe2+)對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響(以氯鹽的形式存在)。同時(shí)分析了100 mmol/L吐溫-80、Tritonx-100和十二烷基硫酸鈉(sodium docecyl sulfate，SDS)等不同表面活性劑對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響[16]。

1.2.11 聚半乳糖醛酸酶的貯藏穩(wěn)定性

在4 ℃和30 ℃的下放置30 d，每隔5 d測(cè)定1次酶活。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析軟件采用SPSS 17.0軟件分析顯著性差異；做圖采用Origin 2017軟件；所有的試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉半乳糖醛酸酶的部分純化分析

聚半乳糖醛酸酶的部分純化結(jié)果如表1所示，純化倍數(shù)達(dá)2.1倍，回收率達(dá)94.53%，隨著蛋白含量變低，比酶活變大，雜蛋白隨著分離純化的進(jìn)行被分離出去。

表1 棘孢木霉多聚半乳糖醛酸酶的部分純化結(jié)果

SDS-PAGE電泳圖以及活性檢測(cè)如圖1所示，計(jì)算得出分子質(zhì)量為50.46、34.21、31.66、29.29 kDa。通過(guò)活性檢測(cè)也證明具有降解活性的分子質(zhì)量為29.29～50.46 kDa。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定的聚半乳糖醛酸酶其分子質(zhì)量范圍與其他學(xué)者研究的結(jié)果一致，如草酸青霉菌CZ 1028、枯草芽孢桿菌PB1和黑曲霉MTCC 3323產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶分子質(zhì)量分別為38、43.1、34、69 kDa[17-19]。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-部分純化的聚半乳糖醛酸酶；2-聚半乳糖醛酸酶的酶譜分析圖1 聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析和活性檢測(cè)

2.2 pH對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響

由圖2-A得出聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)pH為4.0，pH向堿性方向遷移時(shí)酶活急劇下降，在pH 7.0時(shí)幾乎喪失了初始活性的65.0%，說(shuō)明該酶屬酸性酶，結(jié)果與NITURE[20]相似。圖2-B表明，在pH 3.0～5.0保溫60 min仍保持80%的活性，穩(wěn)定性較好?；钚灾行陌被岬馁|(zhì)子化導(dǎo)致酶的天然結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化而影響酶活性[21-22]。與Sigma公司的商品酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)pH與商品酶相接近，但穩(wěn)定性上在pH為3和5時(shí)該酶酶活僅損失20%左右，而商品酶損失50%左右[23]。

A-pH對(duì)酶活性的影響；B-pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響圖2 pH對(duì)棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.3 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響

通過(guò)圖3-A觀(guān)察到，聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)溫度是40 ℃，但溫度的升高會(huì)使酶分子發(fā)生三維結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致酶變性失活[16]，這與真菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的行為幾乎是一致的[24-25]。圖3-B中酶在30～50 ℃下保溫60 min后，酶活性依然保持在80%以上，而在60～70 ℃保溫60 min后，酶活性下降了50%以上，說(shuō)明該酶在30～50 ℃穩(wěn)定性較好。這可歸因于純化酶在高溫下的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變性[26-27]。在與Sigma公司以及北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司的進(jìn)行比較，該酶的最適溫度為40 ℃，而商品酶是30 ℃，在溫度30 ℃時(shí)保持90%以上的活性說(shuō)明該酶在高溫條件下仍能保持較好活性。在50～70 ℃商品酶酶活損失超過(guò)了80%，該酶的酶活損失小于60%，該酶在較高溫度下穩(wěn)定性較好[23,28]。

A-溫度對(duì)酶活性的影響；B-pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響圖3 溫度對(duì)棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.4 緩沖液對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響

酶與底物反應(yīng)取決于帶電分子的運(yùn)動(dòng)，緩沖液的離子是將底物的帶電基團(tuán)與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合的重要標(biāo)準(zhǔn)。由圖4可知，乙酸緩沖液較適用于果膠與聚半乳糖醛酸酶的結(jié)合以及酶活性部位帶電基團(tuán)的移動(dòng)。

圖4 不同緩沖液對(duì)棘孢木霉聚半乳糖酶活性的影響

2.5 底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由圖5-A可知，部分純化的聚半乳糖醛酸酶對(duì)果膠具有較高的特異性，而對(duì)羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)和木聚糖無(wú)酶活性；通過(guò)圖5-B計(jì)算聚半乳糖醛酸酶的米氏常數(shù)Km值為0.74 mg/mL，Vmax為3 100 μg/min。其測(cè)定結(jié)果與CHENG等[17]研究的草酸青霉菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的Km值1.27 mg/mL和SILVA等[29]研究的利迪鏈霉菌CZ1028產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的Km值(1.63 mg/mL)相比較表明棘孢木霉產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶與底物的親和能力較好。

A-底物特異性；B-動(dòng)力學(xué)參數(shù)圖5 棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.6 貯藏穩(wěn)定性

由圖6-A可知,聚半乳糖醛酸酶在4、30 ℃下儲(chǔ)存30 d后酶活保留率為初始酶活的70.0%以上，相比之下在4 ℃條件下貯藏性能較好。這就表明在4 ℃和30 ℃這樣一個(gè)寬泛溫度的環(huán)境下具有良好的貯存特性，可以大大節(jié)約了貯存的成本。NAWAZ等[30]在研究α-葡萄糖苷酶時(shí)也發(fā)現(xiàn)該酶游離狀態(tài)下在4、 30 ℃下儲(chǔ)存30 d其酶活也保持在70%左右。

在此基礎(chǔ)上還進(jìn)行了發(fā)酵液pH變化的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖6-B所示，表明在貯藏過(guò)程中發(fā)酵液的pH逐漸下降，但在4、30 ℃下兩者的pH相差并不大。更加驗(yàn)證了該酶在酸性的條件下可以發(fā)揮良好的酶活特性。

A-貯藏穩(wěn)定性；B-pH變化圖6 聚半乳糖酶在不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性以及pH變化

2.7 金屬離子和表面活性劑對(duì)聚半乳糖酶活性的影響

由圖7-A可知，Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+對(duì)聚半乳糖醛酸酶有激活效果，其中Ca2+激活效果最好；而Co2+、Zn2+、Ba2+、Li+、Fe2+對(duì)聚半乳糖醛酸酶顯現(xiàn)抑制作用，其中Zn2+抑制性最強(qiáng)。這種抑制作用可歸因于羧基的“嵌段”，其可捕獲酶分子并因此阻止酶水解反應(yīng)的進(jìn)行[31]。由圖7-B可知，在表面活性劑中Tritonx-100明顯提高了酶的活性，而吐溫-80和SDS則抑制聚半乳糖醛酸酶的活性，約喪失37.8%和47.04%的活性。

A-金屬離子；B-表面活性劑圖7 金屬離子和表面活性劑對(duì)棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性的影響

3 結(jié)論

本文以課題組篩得的Trichodermaasperelham(保藏號(hào)為 CGMCC No:14636) 所產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶為研究對(duì)象，結(jié)果表明該酶在乙酸乙酸鈉的緩沖溶液環(huán)境下酶活反應(yīng)較好，通過(guò)(NH4)2SO4沉淀和透析袋透析后獲得分子質(zhì)量在29.29～50.46 kDa的純化酶，該酶比酶活為257.41 U/mg，純化倍數(shù)為2.1倍。該酶的最適反應(yīng)pH為4，在pH 3.0～5.0保溫60 min其酶活仍保持80%以上，具有了良好的耐酸性；最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～50 ℃保溫60 min其酶活仍保留80%以上，熱穩(wěn)定性較好;并且該酶純化后對(duì)果膠具有較高的特異性；表面活性劑Tritonx-100和Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+金屬離子對(duì)該酶具有一定的激活作用；通過(guò)計(jì)算該酶的米氏常數(shù)Km值為0.74 mg/mL，Vmax為3 100 μg/min，與底物的親和力較好；并且本研究發(fā)現(xiàn)該酶的貯藏性能較好，在4、 30 ℃下儲(chǔ)存30 d其酶活也保持在70%左右,可為果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。