PTTG1IP在甲狀腺濾泡上皮細胞起源腫瘤中的表達及意義

劉志敏，劉天卿，王紅龍，劉 楠

(1.大連市友誼醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌1科，遼寧 大連 116027)

PTTG1IP(pituitary tumor transforming gene binding factor, PBF/PTTG1IP)為一種原癌基因，于2000年被Chien和Pei等人首次發(fā)現(xiàn)[1]。PTTG1IP是調(diào)節(jié)細胞周期的重要分子，主要調(diào)節(jié)細胞從分裂中期向后期的轉(zhuǎn)化，并控制染色體單體的釋放[2]。因此，PTTG1IP功能異常，可以導(dǎo)致細胞增殖異常。在體內(nèi)實驗中已證實，PTTG1IP具有轉(zhuǎn)化功能，可誘導(dǎo)無胸腺的裸鼠在皮下形成高度惡性的腫瘤[3]。PTTG1IP過表達已在乳腺癌等腫瘤中檢測到[4]。

PTTG1IP蛋白功能多樣，在甲狀腺濾泡上皮細胞中，除調(diào)控細胞增殖外，還具有調(diào)節(jié)甲狀腺濾泡細胞的鈉碘同向轉(zhuǎn)運體(sodium iodide symporter, NIS)和單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白8(monocarboxylate transporter 8, MCT8)功能的作用[5-6]，從而影響濾泡細胞對碘的攝取。部分研究顯示：在甲狀腺PTTG1IP特異性過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中，甲狀腺濾泡細胞基因穩(wěn)定性下降[7]，甲狀腺明顯增大并出現(xiàn)甲狀腺濾泡增生性病變—巨濾泡腺瘤[8]。這些研究提示，PTTG1IP蛋白過表達可能與甲狀腺濾泡性腫瘤有關(guān)。目前，關(guān)于PTTG1IP蛋白在人甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤中的表達情況及意義尚不清楚。有研究者發(fā)現(xiàn)，PTTG1IP蛋白在乳頭狀癌組織中的表達高于正常甲狀腺組織[9]。

甲狀腺腫瘤中，濾泡上皮起源的腫瘤最為常見，主要包括良性腫瘤—濾泡性腺瘤、分化型的癌—乳頭狀癌和濾泡癌、差分化的癌—未分化癌等。不同甲狀腺濾泡上皮起源的腫瘤，不僅在組織學(xué)形態(tài)、生物學(xué)行為等方面不同，分子表型也具有很大差異。例如，甲狀腺乳頭狀癌具有較高的BRAFV600E突變，已經(jīng)用于協(xié)助臨床病理診斷及提示預(yù)后；而濾泡癌則具有較高的RAS和TP53突變[10]。分析比較甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤的分子表型，對認識不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、對不同腫瘤進行正確診斷及治療具有重要的意義。

本研究收集了多種不同類型的甲狀腺組織，包括正常甲狀腺組織、濾泡性腺瘤、乳頭狀癌、濾泡癌和未分化癌，檢測PTTG1IP蛋白在各類組織中的表達情況，分析PTTG1IP蛋白在甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

收集大連市友誼醫(yī)院與大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2005—2019年間的甲狀腺石蠟包埋標本。甲狀腺濾泡性腺瘤患者23例，其中男性9例，女性14例，年齡36～68歲；甲狀腺乳頭狀癌患者65例，其中男性16例，女性49例，年齡23～78歲，其中25例切取距癌腫>1 cm的正常甲狀腺組織作為癌旁正常組織；甲狀腺濾泡癌患者19例，其中男性10例，女性9例，年齡31～74歲；甲狀腺未分化癌患者18例，其中男性8例，女性10例，年齡54～86歲。所有病理參數(shù)包括組織學(xué)類型、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況均由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師獨立完成。依據(jù)2017年版內(nèi)分泌器官腫瘤WHO分類，結(jié)合患者臨床病理資料，對患者進行TNM分期。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

兔抗人PTTG1IP多克隆抗體購自美國劍橋Abcam公司、二抗(MaxVision-HRP)及DAB顯色液均購自中國福州邁新生物技術(shù)公司。

所有病例組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片，按照如下步驟進行操作：二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、95%乙醇2 min、85%乙醇2 min、75%乙醇2 min、H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min、Tris-EDTA緩沖液(pH 9.0)微波抗原修復(fù) 15 min、一抗室溫孵育1 h(1∶250)、二抗10 min、DAB顯色、流水沖洗 15 min、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片。用已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

上皮細胞膜、細胞漿或細胞核出現(xiàn)淡黃色顆粒判定為陽性細胞。根據(jù)陽性細胞的染色強度和比例對每張切片分別進行評分。染色強度評分：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。陽性細胞比例評分：無陽性細胞，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；≥51%，3分。兩個得分相乘，最后得分≤3分記為陰性病例，>3分記為陽性病例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用χ2檢驗分析甲狀腺不同組織類型中PTTG1IP蛋白表達的差異性及PTTG1IP蛋白表達與患者臨床病理特征間的關(guān)系。應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTTG1IP蛋白在甲狀腺不同組織類型中的表達情況

PTTG1IP蛋白在甲狀腺癌癌旁正常組織、濾泡性腺瘤、乳頭狀癌、濾泡癌及未分化癌的腫瘤細胞中均有表達。PTTG1IP蛋白在癌旁正常組織表達率為28%，在濾泡性腺瘤組織中為30.43%，在乳頭狀癌組織中為61.54%，在濾泡癌組織中為31.58%，在未分化癌組織中為22.22%。

PTTG1IP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達率顯著高于癌旁正常組織(P=0.004)、濾泡性腺瘤組織(P=0.010)、濾泡癌組織(P=0.021)和未分化癌組織(P=0.003)。見表1和圖1。

表1 PTTG1IP蛋白在甲狀腺不同組織類型中的表達

A: 正常甲狀腺；B：濾泡性腺瘤；C：乳頭狀癌；D：濾泡癌；E：未分化癌圖1 甲狀腺不同組織類型中PTTG1IP蛋白的表達(×400)Fig 1 Expressions of PTTG1IP protein in different types of thyroid tissue (×400)

2.2 PTTG1IP蛋白在甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤中的表達特點

PTTG1IP蛋白不僅在具有經(jīng)典形態(tài)的甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達，在本實驗所包含的2例濾泡亞型乳頭狀癌也均陽性表達，陽性表達的40例中，26例為強表達，14例為中等強度表達；在PTTG1IP蛋白陽性表達的6例濾泡癌中，僅有1例為強表達，其余5例均為中等強度表達；在PTTG1IP蛋白陽性表達的4例未分化癌中，僅有1例為強表達，其余3例均為中等強度表達。

2.3 PTTG1IP蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系

在甲狀腺乳頭狀癌中，≥55歲年齡組的PTTG1IP蛋白表達率(84.00%)顯著高于<55歲年齡組的表達率(47.75%)；有甲狀腺外侵犯組表達率(75.00%)顯著高于無甲狀腺外侵犯組的表達率(41.67%)；TNM分期Ⅲ-Ⅳ組的表達率(88.24%)顯著高于TNM分期Ⅰ-Ⅱ組的表達率(52.08%)。見表2。

甲狀腺濾泡癌及未分化癌的PTTG1IP蛋白表達率與患者臨床病理特征之間均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

甲狀腺濾泡上皮起源的腫瘤組織類型多樣，均具有各自典型的組織學(xué)形態(tài)。濾泡腺瘤為單發(fā)的、具有完整包膜的、濾泡大小較一致的良性甲狀腺腫瘤；乳頭狀癌為顯示濾泡分化形態(tài)及具有特征性的核的分化型甲狀腺癌；濾泡癌為具有濾泡分化的、侵犯包膜和/或血管的、且缺乏乳頭狀癌特征性核的分化型甲狀腺癌；未分化癌為全部或部分由未分化細胞構(gòu)成、免疫組化和超微結(jié)構(gòu)特征表明具有濾泡上皮分化的癌。甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤亦具有不同的生物學(xué)行為：乳頭狀癌的擴散方式主要為局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，濾泡癌主要為血行播散，而未分化癌則表現(xiàn)為廣泛的局部侵襲及遠處轉(zhuǎn)移。因此，闡明甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制及對不同腫瘤進行正確識別具有重要的意義。

表2 PTTG1IP蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征間的關(guān)系

PTTG1IP蛋白在人類多種正常組織中表達，其氨基酸肽序列與人類其他蛋白無明顯同源性，但是在多物種間具有高度保守性，提示其可能具有獨特的功能，并在物種進化中發(fā)揮重要作用。學(xué)者對PTTG1IP蛋白與腫瘤關(guān)系的關(guān)注始于一項垂體腫瘤的研究。該項研究顯示，PTTG1IP蛋白在垂體腫瘤組織中的表達高于正常垂體組織，提示PTTG1IP可能參與腫瘤的發(fā)生[11]。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)PTTG1IP蛋白在多種惡性腫瘤中存在過表達，包括結(jié)腸癌和乳腺癌等[12]。除蛋白過表達外，基因突變亦可能引起PTTG1IP功能異常。但一項菌落形成實驗顯示，PTTG1IP基因突變并不能引起菌落生長，因此，在癌癥的發(fā)生中，PTTG1IP蛋白過表達可能是比基因突變更為重要的分子事件[13]。

在本研究中，我們檢測了正常甲狀腺組織、濾泡性腺瘤、乳頭狀癌、濾泡癌及未分化癌組織中PTTG1IP蛋白的表達情況。結(jié)果顯示：PTTG1IP蛋白在檢測的所有甲狀腺組織類型中均有表達，但僅在乳頭狀癌組織中表達明顯升高。PTTG1IP蛋白在乳頭狀癌組織中的表達率顯著高于正常甲狀腺組織和濾泡性腺瘤組織，并且顯著高于濾泡癌和未分化癌。這些結(jié)果提示：一方面，在甲狀腺濾泡上皮細胞起源的腫瘤中，PTTG1IP蛋白可能與乳頭狀癌的發(fā)生有關(guān)，而與濾泡癌及未分化癌的發(fā)生無關(guān)；另一方面，PTTG1IP蛋白可能是鑒別乳頭狀癌與甲狀腺良性病變及其他惡性濾泡上皮性腫瘤的一個有用指標。Read等[14]亦發(fā)現(xiàn)，PTTG1IP在分化型甲狀腺癌中高表達。本研究中，在人甲狀腺濾泡上皮起源的不同腫瘤中，PTTG1IP蛋白在乳頭狀癌組織中表達顯著升高，而如前所述，在甲狀腺PTTG1IP特異性過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中，卻出現(xiàn)巨濾泡腺瘤性病變[8]，推測這項動物實驗僅提示PTTG蛋白過表達具有刺激甲狀腺濾泡上皮異常增生的作用，而能否導(dǎo)致乳頭狀癌等更為復(fù)雜的惡性病變，可能需要更多實驗、更長的實驗周期來驗證。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)在高年齡組、伴有甲狀腺外侵犯組及高TNM分期組的甲狀腺乳頭狀癌組織中，PTTG1IP蛋白表達率均明顯升高，提示PTTG1IP蛋白過表達可能促進乳頭狀癌的進展。一項體外實驗表明，PTTG1IP可以通過調(diào)節(jié)細胞侵襲性偽足相關(guān)蛋白的功能而促進甲狀腺細胞的浸潤和遷移[15]，這也提示了PTTG1IP蛋白促進甲狀腺乳頭狀癌進展的可能機制，仍需進一步研究。

乳頭狀癌是甲狀腺最常見的惡性腫瘤[16]，大部分患者預(yù)后良好，但仍有部分患者預(yù)后較差。有研究表明，PTTG1IP與甲狀腺癌患者差的預(yù)后有關(guān)[14]。放射碘消融是治療甲狀腺癌最重要的術(shù)后輔助手段，NIS是放射碘消融甲狀腺腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的重要相關(guān)基因。在甲狀腺過表達PTTG1IP的小鼠模型中，NIS表達明顯受抑制，甲狀腺攝取碘的能力明顯下降[8]。另一項研究也提示了PTTG1IP蛋白對放射碘消融效果的影響：改變PTTG1IP蛋白的磷酸化狀態(tài)，可以克服PTTG1IP蛋白對甲狀腺攝取碘的抑制，從而增加放射碘消融的療效[17]。

綜上所述，一方面，在甲狀腺濾泡上皮起源的多種腫瘤中，PTTG1IP蛋白過表達可能與乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而與濾泡癌及未分化癌的發(fā)生發(fā)展無關(guān)；另一方面，PTTG1IP蛋白可能是鑒別乳頭狀癌與甲狀腺良性病變及其他惡性濾泡上皮性腫瘤的一個有用指標；此外，PTTG1IP蛋白過表達可以抑制甲狀腺癌細胞對放射碘的攝取，從而降低放射碘消融的效果，從而導(dǎo)致部分患者預(yù)后較差。因此，PTTG1IP可能為難治的乳頭狀癌提供新的治療靶點。