番瀉苷A與B的生物穩(wěn)定性研究

于波濤，宋宗輝，范開華，陳 華，浦志強，金偉華

番瀉苷是番瀉葉、大黃等瀉下藥物的主要成分，分為番瀉苷A、B、C和D[1]?？诜瑸a苷的藥物后，轉運至大腸部位被細菌分解成大黃酸蒽酮，對大腸產生瀉下作用。小橋恭一等從人糞便中分離出多種番瀉苷的代謝菌，其中Bifidobacteriumsp.SEN可以將番瀉苷轉化為番瀉苷元，另外一些腸內菌株可以將番瀉苷元向大黃酸蒽酮轉化[2]。為探究番瀉苷的生物穩(wěn)定性，本試驗以番瀉苷A和番瀉苷B的含量變化為指標，考察番瀉苷在人工胃液、人工腸液以及在腸道細菌作用下的分解情況，為相關制劑的研制和生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料和設備

1.1.1儀器 HP 1100高效液相色譜儀(G1311A Quat Pump泵，G1315A DAD 紫外檢測器，Phenomenex Gemini C18分析柱，美國 Agilent公司)；PYX-DHS-40×50-S-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療儀器廠。

1.1.2試劑及藥品 番瀉苷A對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：F-002-130106，HPLC≥98%，CAS：81-27-6)，番瀉苷B對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：F-003-131001，HPLC≥98%，CAS：128-57-4)；胃蛋白酶(Biosharp公司，活性成分含量：1∶3000單位，)，胰蛋白酶(Biosharp公司，活性成分含量：1∶250單位)；營養(yǎng)肉湯(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20120702)。

1.2方法

1.2.1溶液配制 (1)番瀉苷A與B儲備液:分別精密稱取番瀉苷A和番瀉苷B對照品6.82 mg、6.52 mg，用0.1%碳酸氫鈉溶液溶解并分別稀釋定容至50 ml 容量瓶中，得濃度分別為 136.4 μg/ml和130.4 μg/ml的番瀉苷A和番瀉苷B儲備液。(2)人工胃液[3]:取稀鹽酸16.4 ml，加水約800 ml與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1000 ml。(3)人工腸液[3]:取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 ml使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至6.8；另取胰酶10 g，加適量水溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000 ml。(4)厭氧培養(yǎng)液[4]:取A液(0.78%磷酸氫二鉀)375 ml和B液(0.47%磷酸二氫鉀，1.18%氯化鈉，1.2%硫酸銨，0.12%氯化鈣，0.25%硫酸鎂)375 ml混勻，再加入5 g L-半胱氨酸，20 ml 25% L-抗壞血酸，500 ml 8%碳酸鈉，營養(yǎng)肉湯10 g，調pH值為7.5～8.0，最后分裝于玻璃瓶中并消毒滅菌。

1.2.2色譜條件 分析柱為Phenomenex Gemini C18(4.6 mm ID× 250 mm，5 μm)，預柱:YWG-ODS(4.6 mm ×10 mm，10 μm)；流動相：乙腈-2.7%冰醋酸溶液(18∶82)；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：λ=270 nm。

1.2.3標準曲線的制備 精密吸取1.2.1項不同體積番瀉苷A儲備液，并用蒸餾水稀釋定容，得濃度分別為 2.955、5.91、11.82、23.64、47.28、59.1 μg/ml的系列番瀉苷A對照品溶液；番瀉苷B同法操作，得濃度分別為1.304、2.608、5.216、10.432、20.864、52.16 μg/ml的系列番瀉苷B對照品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取10 μl進行HPLC測定，記錄峰面積，以峰面積對藥物濃度進行回歸分析，回歸方程分別為:YA=-0.8596+6.2656C(r= 0.9999)，表明番瀉苷A在2.955～59.1 μg/ml濃度范圍內線性關系良好；YB=-1.0661+5.8023C(r=0.9999)，表明番瀉苷B在1.304～52.16 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

1.2.4精密度及穩(wěn)定性試驗 取1.2.3項下低、中、高濃度分別為2.955、23.64和59.1 μg/ml的番瀉苷A和濃度為1.304、20.864和52.16 μg/ml的番瀉苷B對照品溶液，在上述色譜條件下，分別進樣各10 μl，連續(xù)測定5次，記錄峰面積，計算番瀉苷A的相對標準偏差(RSD)分別為0.3724%、1.5741%和2.4738%(n=5)，番瀉苷B的RSD分別為0.2532%、1.5700%和2.6157%(n=5)，表明精密度良好。同法取番瀉苷A(23.64 μg/ml)與B(20.864 μg/ml)對照品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、8 h進樣測定峰面積，計算番瀉苷A及番瀉苷B的RSD(n=5)，結果表明穩(wěn)定性滿足測定要求。

1.2.5番瀉苷A或B在人工胃液與人工腸液中的降解試驗 精密量取5 ml番瀉苷A儲備液，分別加入到5 ml人工胃液和人工腸液中，混勻，分裝于安瓿中，熔封，置于37 ℃恒溫水浴鍋加熱，于0、3、5、7 h時分別取樣，微孔濾膜濾過，每次取續(xù)濾液10 μl進樣，在上述色譜條件下，測定番瀉苷A的峰面積，以0時刻初始濃度為100%，計算不同時刻藥物相對殘留率。番瀉苷B同法操作。

1.2.6番瀉苷A或B的腸道細菌降解試驗 取6名健康志愿者(表1)新鮮糞便，每5 g糞便加5 ml生理鹽水混勻，離心取上清液2.5 ml，與預熱至37 ℃的厭氧培養(yǎng)營養(yǎng)液10 ml混合制成腸菌培養(yǎng)液，再加入番瀉苷A或B 0.5 ml(濃度約為1 mg/ml，空白腸菌培養(yǎng)液不含番瀉苷，平行加生理鹽水0.5 ml)，混勻，精密移取2 ml分裝于已消毒的6個EP管內，將EP管放入無氧袋中，充入CO2，置于37 ℃真空干燥箱內，每隔15 min取出樣品，加入4 ml甲醇漩渦震蕩沉淀蛋白，離心，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取其續(xù)濾液進樣10 μl，在上述色譜條件下，記錄番瀉苷A或B的峰面積，以0時刻初始濃度為100%，計算不同時刻藥物相對殘留率。

表1 6名健康志愿者性別和年齡

2 結果

2.1番瀉苷在人工胃液和人工腸液中不同時間的含量變化 在37 ℃條件下，7 h內，番瀉苷A或B在人工胃液和人工腸液中的含量均無明顯變化(表2)，說明番瀉苷A或B在人工胃液和人工腸液中較穩(wěn)定。

2.2腸道細菌對番瀉苷降解結果 空白腸菌培養(yǎng)液對番瀉苷A或B的測定沒有干擾，番瀉苷A和B腸菌營養(yǎng)液HPLC色譜見圖1。試驗結果表明，番瀉苷A及B在腸道細菌作用下，降解50%分別需要(60±7)min和(37±6)min，且番瀉苷B降解速率明顯高于番瀉苷A(圖2)。此外，通過對番瀉苷A與B在<54歲及以上受試者平均殘留量的比較，發(fā)現有顯著性差異(P<0.01，表3)。

表2 番瀉苷在人工胃液與人工腸液中不同時間的峰面積值(n=3)

表3 不同年齡組番瀉苷A和番瀉苷B殘留率(%)

圖1 番瀉苷A和B腸菌營養(yǎng)液色譜圖

圖2 番瀉苷A與B不同時間腸道細菌降解殘留率

3 討論

許多中藥成分都是借助腸道細菌的作用轉化為有效成分而達到治療作用[5]，研究腸道細菌對番瀉苷代謝規(guī)律，有利于了解其在體內的整個代謝過程，預測其藥效在體內發(fā)揮的大致時間。由圖2可推測，隨腸道細菌培養(yǎng)時間的增長，番瀉苷A或B在2 h后將被腸道細菌大部分解，為番瀉苷制劑的服用方法及時間提供較科學的參考。

研究同時發(fā)現，<54歲受試者腸道細菌對番瀉苷的降解轉化作用明顯優(yōu)于≥54歲人群，這主要與不同年齡者腸道厭氧菌多寡有關[6]。因此，在給予≥54歲中老年人使用番瀉苷制劑清潔腸道或治療便秘時，建議增加含雙岐菌乳制品或服用腸道細菌活菌片，有助于更好地發(fā)揮番瀉苷的功效。

【參考文獻】

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[5] 肖娟,王瑩.中藥化學成分腸道菌群代謝的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(5):247-250.

[6] 張圣潔，郭錦瑞.腸道菌群對中藥糖苷類成分脫糖基代謝的研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38(10)：1459-1464.