嶺南山竹子醇提物對LPS致RAW264.7細(xì)胞炎性損傷的保護作用研究

黃雷 劉美瓊 張小曼 蘇少鋒 鄒小琴 鐘小斌 馮潔

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1719-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.11

摘 要 目的：探討嶺南山竹子70%乙醇提取物（GOEE）對脂多糖（LPS）致RAW264.7細(xì)胞炎性損傷的保護作用及其潛在分子機制。方法：取嶺南山竹子果皮用70%乙醇回流提取，制得GOEE。采用Folin-Ciocalteau法和紫外-可見分光光度法分別測定GOEE中總多酚和總黃酮的含量。采用MTT法檢測不同劑量GOEE的細(xì)胞毒性;以LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥模型，分別以地塞米松、N-乙?；?L-半胱氨酸為陽性對照，采用Griess法和2′，7′-二氯熒光素法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）和細(xì)胞中活性氧（ROS）的含量;采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和IL-1β水平;采用Western blotting法測定細(xì)胞中p65蛋白（p65）、磷酸化p65（p-p65）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、血紅素加氧酶-1（HO-1）以及細(xì)胞核內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）蛋白的表達水平。結(jié)果：GOEE中總多酚與總黃酮的含量分別為（20.191±1.264）、（12.571±0.020）mg/g。當(dāng)劑量≤500 μg/mL時，GOEE對RAW264.7細(xì)胞存活率無顯著影響（P>0.05）。與對照組比較，LPS模型組NO、ROS含量，TNF-α、IL-6、IL-1β水平，p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值以及NRF2蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與LPS模型組比較，陽性對照組和GOEE各處理組細(xì)胞NO（除GOEE 50 μg/mL處理組外）、ROS含量，TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均顯著降低，HO-1、NRF2蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：GOEE可通過抑制炎癥反應(yīng)、抑制核因子κB通路磷酸化、促進NRF2蛋白入核等途徑來減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎性損傷。

關(guān)鍵詞 嶺南山竹子;果皮;醇提物;抗炎作用;核因子κB;核因子E2相關(guān)因子2;小鼠巨噬細(xì)胞;RAW264.7

Study on Protective Effects of the Ethanol Extract of Garcinia oblongifolia on LPS-induced RAW264.7 Cell Inflammatory Injury

HUANG Lei1，2，LIU Meiqiong2，ZHANG Xiaoman2，SU Shaofeng2，ZOU Xiaoqin3，ZHONG Xiaobin1，F(xiàn)ENG Jie2 （1. Dept. of Pharmacy， Langdong Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530029， China; 2. TCM Teaching and Research Section， School of Pharmaceutical Sciences， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Dept. of Scientific Research， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the anti-inflammatory activity of 70%ethanol extracts from Garcinia oblongifolia （GOEE） on LPS-induced RAW264.7 cells and its potential molecular mechanism. METHODS： GOEE was obtained after the fresh G. oblongifolia epicarp refluxed with 70% ethanol. The contents of total phenol and total flavonoids were determined by Folin-Ciocalteau assay and UV spectrophotometer. MTT assay was used to detect the cytotoxicity of different doses of GOEE. The inflammatory model was induced in RAW264.7 cells by lipopolysa- ccharide （LPS）. Using dexamethasone and N-acetyl-L-cysteine as positive control， Griess assay and 2′， 7′-dichloro- fluorescein assay were used to detect the contents of NO in cell culture medium and ROS in cells. The levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in cell culture medium were measured by ELISA. The protein expression of p65， p-p65， IκBα， p-IκBα， HO-1 in cells and NRF2 in nucleus were determined by using Western blotting assay. RESULTS： The contents of total phenol and flavonoids in GOEE were （20.191±1.264）and （12.571±0.020）mg/g， respectively.? At the concentration below 500 μg/mL， GOEE had no significantly effect on survival rate of RAW264.7 cells （P>0.05）. Compared with control group， the contents of NO and ROS， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β， ratio of p-p65 to p65， ratio of p-IκBα to IκBα， protein expression of NRF2 were increased significantly in LPS model group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with LPS model group， the contents of NO （except for GOEE 50 μg/mL group） and ROS， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β， ratio of p-p65 to p65 and ratio of p-IκBα to IκBα were decreased significantly in GOEE groups and positive control groups， while protein expression of HO-1 and NRF2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： GOEE attenuates LPS-induced macrophages inflammation injury by inhibiting the inflammatory response and the phosphorylation of NF-κB pathway， promoting NRF2 protein transportation to the nucleus.

KEYWORDS? ?Garcinia oblongifolia; Epicarp; Ethanol extract; Anti-inflammatory effect; NF-κB; NRF2; Mice macrophage; RAW264.7

炎癥是機體抵御感染和組織損傷的一種防御機制，許多慢性炎癥性疾?。ㄈ缣悄虿?、動脈粥樣硬化等）可能是由于過度的炎癥反應(yīng)所引起的[1]。當(dāng)各種內(nèi)在或外在的刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞過度活化時，炎癥細(xì)胞被激活并維持免疫反應(yīng)。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化可能將有利于許多炎癥性疾病的治療。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的內(nèi)毒素，通常用于誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞以建立炎癥模型[2]。LPS還可使核因子κB（NF-κB）活化，活化的NF-κB可進一步誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和IL-1β。而促炎細(xì)胞因子能夠刺激機體產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），從而打破機體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡，造成氧化應(yīng)激[3]。若機體長時間處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，可進一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、組織壞死[4]。核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，有文獻報道，激活NRF2可保護機體免受急性肺損傷、急性肝衰竭等各種炎癥性疾病的侵害[5-6]。因此，NRF2與NF-κB一同作為炎癥性疾病的潛在治療靶標(biāo)引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。

嶺南山竹子（Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.）屬于藤黃科藤黃屬植物，主要分布于我國廣西、廣東地區(qū)。據(jù)文獻報道，從嶺南山竹子的樹皮中分離出來的Garcinone C、Griffipavixanthone、Oblongifolin M、Norcowanin等化合物具有抗腫瘤、抗糖尿病和抗病毒等活性[8-11]。然而，國內(nèi)外現(xiàn)有研究主要集中于嶺南山竹子的樹皮與樹葉，且多為簡單的活性成分研究。由于民間主要是以嶺南山竹子的果皮入藥以消炎鎮(zhèn)痛，有關(guān)該藥果皮化學(xué)成分的研究僅有1篇報道[12]，而有關(guān)其藥理作用尤其是抗炎抗氧化活性的研究等尚未見相關(guān)報道。為此，本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型，通過檢測一氧化氮（NO）、ROS的含量以及促炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等炎性靶標(biāo)表達水平的變化，初步探討嶺南山竹子70%乙醇提取物（GOEE）的抗炎活性及其潛在的分子機制，旨在為治療炎癥性疾病提供更多的候選藥物。

1 材料

1.1 儀器

EL204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;TV-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;WIX-miniPRO4型迷你垂直電泳槽（北京韋克斯科技有限公司）;Odyssey型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）;SpectraMax Plus384型連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）;SynergyTM H1全功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司）;ACB-4A1型超凈工作臺（新加坡ESCO公司）;3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

新鮮嶺南山竹子于2017年7月采集于廣西壯族自治區(qū)北海市，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)馮潔教授鑒定為藤黃科藤黃屬嶺南山竹子（G. oblongifolia Champ. ex Benth.）的新鮮果實。藥材標(biāo)本（編號：GB20170728）保存于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

LPS（美國Sigma公司，批號：L2880）;NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181007）;TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：CK-E20220M、CK-E20012M、CK-E20533M）;兔源磷酸化p65（p-p65）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）多克隆抗體（美國ABclonal Technology公司，批號：AP0124、AP0614）;兔源IκBα、p65、NRF2、血紅素加氧酶1（HO-1）、核纖層蛋白B（Lamin B）多克隆抗體和小鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國Proteintech Group公司;批號：10268-1- AP、10745-1-AP、16396-1-AP、10701-1-AP、12987-1-AP、6004-1-1g）;胎牛血清（美國Gemini公司，批號：A87F82H）;高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：8118048）;兔源免疫球蛋白G（IgG）（H+L）熒光二抗、小鼠源IgG （H+L）熒光二抗（美國CST公司，批號：5366P、5257P）;N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）對照品（抗氧化劑，純度：≥99%）、ROS試劑盒[含2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）等試劑]、胞核胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Loading Buffer上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：S0077、S0033、P0027、P0012、P0015）;地塞米松磷酸鈉注射液（DEX，陽性對照，國藥集團容生制藥有限公司，批號：1801207，規(guī)格：1 mL ∶ 2 mg）;MTT、二甲基亞砜（DMSO）、蘆丁對照品（純度：≥99%）、青鏈霉素雙抗（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8180、D8370、YZ-10080、20180418）;沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831- 201906，純度：≥99%）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 GOEE的制備

取新鮮嶺南山竹子果皮（80 g）切成片，用70%乙醇（0.8 L）回流提取3次，每次2.5 h。將提取液過濾并減壓濃縮后，冷凍干燥，即得到GOEE凍干品5.26 g，得率為6.58%。

2.2 GOEE中總多酚與總黃酮的含量測定

采用Folin-Ciocalteau法[13]測定GOEE中的總多酚含量，以沒食子酸為指標(biāo)，結(jié)果以沒食子酸含量表示;采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[14]測定GOEE中總黃酮的含量，以蘆丁為指標(biāo)，使用紫外-可見分光光度計在500 nm波長處檢測樣品含量，方法學(xué)考察內(nèi)容及其結(jié)果見相關(guān)文獻[13-14]。每樣品均重復(fù)測定3次。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.4 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的毒性研究

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以5×104個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機分為對照組（0.5%DMSO）、LPS模型組（1 μg/mL，劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗結(jié)果，下同）和GOEE處理組（15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ?g/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE以生藥量計，劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗結(jié)果），每組設(shè)4個復(fù)孔。除對照組外，其余各組均與LPS共孵育30 min后，再與藥物混合培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 ?L，培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 ?L，避光振搖10 min，采用連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量各孔的吸光度值，并計算各組細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率（%）=試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。上述試驗重復(fù)3次。

2.5 NO含量檢測

采用Griess法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以4×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機分為對照組（0.5%DMSO）、LPS模型組（1 μg/mL）、DEX處理組（陽性對照，0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS，DEX劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗結(jié)果，下同）和GOEE處理組（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE劑量參考“2.4”項下結(jié)果），每組設(shè)4個復(fù)孔。按“2.4”項下方法培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，以1 000 r/min離心5 min，取上清液，采用連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀于550 nm波長處檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，上述試驗重復(fù)3次。

2.6 ROS含量檢測

采用2′，7′-二氯熒光素（DCF）法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以4×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機分為對照組（0.5%DMSO）、LPS模型組（1 μg/mL）、NAC處理組（抗氧化劑，10 mmol/L NAC+1 μg/mL LPS，NAC劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗結(jié)果）和GOEE處理組（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS），每組設(shè)4個復(fù)孔。按“2.4”項下方法培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞與DCFH-DA（10 mmol/L）100 μL孵育30 min，采用全功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處檢測ROS與DCFH-DA反應(yīng)產(chǎn)物（DCF）的熒光強度，并以此表示ROS的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，上述試驗重復(fù)3次。

2.7 TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測

采用ELISA法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以2×105個/mL接種于6孔板中，每孔1 mL。將細(xì)胞隨機分為對照組（0.5%DMSO）、LPS模型組（1 μg/mL）、DEX處理組（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS）和GOEE處理組（100、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE劑量參考前文結(jié)果，下同），每組設(shè)4個復(fù)孔。按“2.4”項下方法培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，以1 000 r/min離心5 min，取上清液，采用ELISA法以連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，上述試驗重復(fù)3次。

2.8 相關(guān)蛋白表達水平檢測

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以4×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機分為對照組（0.5%DMSO）、LPS模型組（1 μg/mL）、DEX處理組（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS;檢測NRF2信號通路相關(guān)蛋白HO-1、NRF2表達時不設(shè)該組）和GOEE處理組（100、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS），每組設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)1 h后，吸棄培養(yǎng)液。分別按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白（用以檢測p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、HO-1蛋白的表達）和細(xì)胞核蛋白（用以檢測NRF2蛋白的表達），用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）稀釋至相應(yīng)濃度。取上述蛋白，加入5×Loading Buffer上樣緩沖液適量，煮沸變性;取變性蛋白樣品50 μg，于80 V條件下行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后于100 mA下濕法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后分別加入p-p65抗體（1 ∶ 500）、p-IκBα抗體（1 ∶ 500）、p65抗體（1 ∶ 1 000）、IκBα抗體（1 ∶ 1 000）、NRF2抗體（1 ∶ 500）、HO-1抗體（1 ∶ 1 000）、Lamin B抗體（1 ∶ 1 000）、GAPDH抗體（1 ∶ 3 000），4 ℃孵育過夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，加入相應(yīng)二抗（除GAPDH為小鼠源二抗外，其余均為兔源二抗，稀釋度均為1 ∶ 10 000），室溫下避光孵育1 h，以TBST溶液清洗10 min×3次。于雙色紅外激光成像系統(tǒng)上成像，并通過Image J2 v5.2.5軟件分析，以p-p65和p65、p-IκBα和IκBα灰度值的比值（p-p65/p65、p-IκBα/IκBα比值）來表示p65、IκBα的磷酸化水平，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（HO-1以GAPDH為內(nèi)參，NRF2以Lamin B為內(nèi)參）的灰度值比值來表示其表達水平。上述試驗重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 總多酚和總黃酮的含量測定結(jié)果

以沒食子酸當(dāng)量計算GOEE中總多酚的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.111 6X+0.018 0（R 2=0.999 0）計算出總多酚含量為（20.191±1.264）mg/g（n=3）。以蘆丁當(dāng)量計算GOEE中總黃酮的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.012 7X-0.017 6（R 2=0.999 4）計算出總黃酮含量為（12.571±0.020）mg/g（n=3）。

3.2 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

LPS模型組細(xì)胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與對照組比較，GOEE 1 000 ?g/mL組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），而當(dāng)GOEE劑量≤500 ?g/mL時，各劑量組細(xì)胞存活率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。根據(jù)上述結(jié)果，本研究選擇GOEE劑量范圍為0～500 ?g/mL進行后續(xù)試驗。

3.3 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO、ROS含量的影響

LPS模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量約為對照組的6.09倍，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與LPS模型組比較，DEX處理組和GOEE 100、150、200、300 μg/mL處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量均顯著降低（P<0.05），且隨著劑量的增加，NO含量有減少的趨勢。與對照組比較，LPS模型組細(xì)胞中ROS的含量顯著升高（P<0.01）;與LPS模型組比較，NAC處理組與GOEE各處理組ROS的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.4 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

與對照組比較，LPS模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高（P<0.05）。與LPS模型組比較，DEX處理組和GOEE各處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），詳見表3。

3.5 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NF-κB活化的影響

與對照組比較，LPS模型組細(xì)胞中p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均顯著升高（P<0.01）;與LPS模型組比較，DEX處理組和GOEE各處理組細(xì)胞中p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖1A、表4。

3.6 GOEE對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NRF2、HO-1 蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS模型組細(xì)胞核中NRF2蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05）;與LPS模型組比較，GOEE各處理組細(xì)胞中HO-1蛋白和細(xì)胞核中NRE2蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖1B、表4。

4 討論

嶺南山竹子是一種民間傳統(tǒng)用藥，主要用于炎癥性不適。其相關(guān)文獻報道多集中于其樹皮及樹葉，但民間多用果皮入藥。為此，本文主要研究了GOEE在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中的抗炎藥理活性及其潛在分子機制。

炎癥反應(yīng)通常由NO、ROS和炎癥細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-6）等介導(dǎo)，而炎癥細(xì)胞因子受NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)。在正常情況下，NF-κB以異二聚體形式與IκBα結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中;LPS能夠激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致IκBα降解，之后NF-κB易位至細(xì)胞核誘導(dǎo)炎癥[15]。因此，通過抑制IκBα降解來下調(diào)NF-κB的表達可能是抗炎藥物的研究路線之一。據(jù)報道，NRF2信號通路與NF-κB通路具有交叉效應(yīng)，炎癥產(chǎn)生的過量ROS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而NRF2信號通路是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中最重要的途徑，該通路被激活后可誘導(dǎo)抗氧化蛋白HO-1等產(chǎn)生，以對抗機體的氧化應(yīng)激，從而保護正常細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害[16]。

NO是炎癥反應(yīng)中傳遞信號的信息分子，是與炎癥疾病有關(guān)的炎癥介質(zhì)之一[17]。本研究結(jié)果表明，GOEE顯著抑制了NO的產(chǎn)生，表明了GOEE能夠通過阻斷炎癥信號的傳遞來發(fā)揮抗炎作用。在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中，包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的水平均顯著升高，提示其促進了炎癥的發(fā)展。因此抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生是治療炎癥性疾病的主要策略之一，這些炎癥因子的表達主要受NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。本研究首先通過MTT法篩選出安全劑量范圍，從此范圍中根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置給藥劑量，并以DEX作為抗炎研究的陽性對照，以NAC作為ROS測定的陽性對照。由于DEX對NRF2信號通路無影響，因此在進行抗氧化研究時未設(shè)DEX組。本研究結(jié)果表明，GOEE可抑制NF-κB中的關(guān)鍵蛋白IκBα和p65的磷酸化，從而抑制NF-κB信號通路的表達及其在下游轉(zhuǎn)錄的促炎細(xì)胞因子表達。有研究表明，在LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥中，NRF2基因敲除小鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達高于未敲除小鼠;進一步研究表明，NRF2基因敲除小鼠的NF-κB p65與DNA有更強的結(jié)合活性[18]。說明NRF2編碼基因的缺失能夠加重炎癥反應(yīng)。HO-1的上調(diào)會促進其衍生代謝產(chǎn)物（如CO、膽紅素等）的產(chǎn)生，這些代謝產(chǎn)物不僅具有抗氧化活性，還具有抗炎作用[19-21]。本研究結(jié)果表明，GOEE抑制了ROS和NO的產(chǎn)生。本研究檢測了細(xì)胞核內(nèi)NRF2的表達情況，發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導(dǎo)NRF2入核，GOEE能進一步促進NRF2入核，并且上調(diào)NRF2調(diào)控的抗氧化酶HO-1的表達。這表明GOEE還能通過上調(diào)NRF2與HO-1抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時，本研究通過測量GOEE中總黃酮與總多酚的含量發(fā)現(xiàn)，GOEE中總多酚的含量遠(yuǎn)高于總黃酮的含量。酚羥基中的鄰位酚羥基易被氧化，是良好的抗氧化劑;同時，酚羥基還可以提供活潑氫，使活性氧等自由基滅活，本身被氧化形成含有鄰二酚結(jié)構(gòu)的自由基而穩(wěn)定存在[22]。因而推測可能是GOEE中多酚類物質(zhì)發(fā)揮了抗氧化與抗炎作用，但有待后續(xù)研究予以確證。

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（收稿日期：2019-12-13 修回日期：2020-05-13）

（編輯：羅 瑞）