五種糖類對犬精液冷凍保存效果的研究

孫玲偉　戴建軍　吳彩鳳　張樹山　張德福

摘要：選取8只身體健康、性欲旺盛的比格公犬，采集其精液，對鮮精進(jìn)行質(zhì)量檢測，主要包括顏色、射精量、精子活率、活力和pH。選取精子活率達(dá)到70%以上犬精液用于后續(xù)精液冷凍試驗(yàn)。分別將含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖的精液稀釋液與精液按照1∶2的比例進(jìn)行稀釋。經(jīng)冷凍解凍后，進(jìn)行活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性的精子質(zhì)量檢測。通過對新鮮精液進(jìn)行品質(zhì)檢測，結(jié)果顯示5只合格用犬的平均射精量為2.85 mL，密度為2.01×108個/mL，pH為6.56。含有果糖的冷凍稀釋液中精子活率和活力最高，分別達(dá)59.90%和54.00%;其次是添加葡萄糖和乳糖的稀釋液中活率較高，分別為59.21%和56.73%，且兩組稀釋液中精子解凍后活力均為52.00%。進(jìn)一步評估精子解凍后質(zhì)膜完整率，結(jié)果顯示葡萄糖和果糖組顯著高于其他組，分別達(dá)48.73%和49.52%;而蔗糖添加組精子質(zhì)膜完整率最低，為42.21%。稀釋液中添加果糖的精子解凍后頂體完整率顯著高于其他組，而添加蔗糖組頂體完整率最低。在比格犬的精液冷凍保存中，添加果糖的冷凍稀釋液能顯著提高精子的活率和活力，從而達(dá)到提高凍精質(zhì)量的效果。

關(guān)鍵詞：犬精液;冷凍;冷凍保護(hù)劑;糖類

中圖分類號：S814.3;S829.2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）06-0010-03

人工授精是一項(xiàng)發(fā)揮優(yōu)秀公畜遺傳潛力的重要現(xiàn)代動物生物技術(shù)，而精液冷凍是實(shí)現(xiàn)人工授精的重要技術(shù)環(huán)節(jié)[1]。目前，牛和羊等動物的冷凍精液已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛用于人工授精和體外受精，進(jìn)行優(yōu)良品種的繁殖。然而，犬的冷凍精液保存效果較差，凍精解凍后精子活力低，用于人工授精后導(dǎo)致受胎率低、產(chǎn)仔數(shù)少等問題。犬的精液冷凍技術(shù)研究開始于1967年，美國對犬精液冷凍做了大量研究，并制定了冷凍精液生產(chǎn)及操作規(guī)程，然而因精子質(zhì)量問題未得到廣泛推廣。有研究使用犬冷凍精液進(jìn)行人工授精，其受胎率雖低于自然交配，但胎兒死亡率、先天性畸形率、初生重及性比例均與自然交配相似[2]。目前，在發(fā)達(dá)國家，犬的精液冷凍保存研究已經(jīng)廣泛開展。我國對犬精液冷凍技術(shù)和人工授精技術(shù)研究始于20世紀(jì)80年代，目前尚處于試驗(yàn)研究階段，生產(chǎn)實(shí)踐中并沒有普及和推廣。潘壽文等[3]報到了德國牧羊犬精液冷凍的研究，凍精人工授精成功。禹學(xué)禮等[4]對豫西土犬的冷凍精液和人工授精試驗(yàn)獲得成功，受胎率達(dá)到57%，平均窩產(chǎn)仔3只。此后，李彩霞[5]、曹授俊等[6]、王素梅等[7]分別做了相關(guān)的研究，但凍精質(zhì)量差、受胎率低一直是制約我國犬精液冷凍技術(shù)發(fā)展的重要因素。

在精液冷凍保存過程中，稀釋液中糖類物質(zhì)不僅能為精子生存以及運(yùn)動提供能量，也能提高精子凍后的活率以及頂體完整性。因此，本試驗(yàn)旨在探尋葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖在比格犬精液冷凍中的添加，并研究其對凍精質(zhì)量的影響，為犬精液冷凍產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考，促進(jìn)犬精液冷凍技術(shù)更加成熟。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)動物

隨機(jī)選取上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院身體健康、生殖器官發(fā)育正常的雄性比格犬8只，年齡2～5歲。犬只單獨(dú)飼養(yǎng)在圍欄里，每天定時定量由固定飼養(yǎng)員飼喂全價種公狗糧，并提供新鮮飲用水，采集精液前1 h禁食。

1.2? 儀器與試劑

犬用集精杯、溫度計、電子分析天平、消毒鍋、離心機(jī)、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、光學(xué)顯微鏡、冰箱、0.5 mL凍精細(xì)管、液氮罐、一次性精子計數(shù)板（邁朗）、精子分析儀（邁朗，SJ-TMDI608）、便攜式pH檢測儀。

三羥甲氨基甲烷（Tris）、甘油、新鮮蛋黃、青霉素、鏈霉素、雙蒸水、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖等均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.3? 方法

1.3.1? 精液處理

（1）精液采集。通過對試驗(yàn)用犬為期2周的采精調(diào)教后，采用手握法收集精液。

（2）鮮精處理。精液采集后，立即記錄射精量、精液pH、精液顏色和氣味，之后進(jìn)行精液品質(zhì)分析，合格的精液進(jìn)行下一步處理。只有射精量≥0.6 mL、精子密度≥2×108個/mL、精子活率≥70%的精液被用于后續(xù)試驗(yàn)[8]。為排除個體差異，將合格的精液進(jìn)行混合后，按照要求進(jìn)行分組稀釋。

（3）精液稀釋液配方。根據(jù)以往文獻(xiàn)，在以Tris為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)稀釋液中，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖作為冷凍保護(hù)劑，配方列于表1[8-10]。之后檢測精液解凍后精子活率、活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。

（4）精液的稀釋與分裝。將經(jīng)檢測合格的精液，在37 ℃下500 r/min離心10 min去除上層精清，將精液用5種稀釋液按照1∶1的比例進(jìn)行稀釋，至最終度為200×106個/mL。將精液包裹8層紗布放置在4 ℃冰箱內(nèi)降溫平衡2 h，分裝至0.5 mL凍精細(xì)管中，并做好標(biāo)記。

（5）精液的冷凍與解凍。將凍精細(xì)管放置距離液氮上方4 cm處，利用液氮熏蒸法熏蒸15 min，之后投入-196 ℃的液氮中儲存，直到評估。解凍時，將凍精細(xì)管快速從液氮中拿出，放入37 ℃的水浴中，來回擺動，30 s即可解凍。將細(xì)管中精液收集至1 mL離心管中，37 ℃孵育30 min，隨后進(jìn)行精液品質(zhì)檢測。

1.3.2? 精液的品質(zhì)檢測

（1）精子密度和精液pH。采用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行測定。采用pH檢測儀進(jìn)行精液的pH檢測。

（2）精子活率和活力測定。取解凍后精液樣品15 μL滴加在37 ℃預(yù)熱的一次性精子計數(shù)板上，在200×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇4個視野，利用精子分析儀，自動識別運(yùn)動精子、直線運(yùn)動精子和死亡精子數(shù)量，經(jīng)計算后形成活率和活力數(shù)據(jù)。其中，精子活率=運(yùn)動精子數(shù)/總精子數(shù)×100%，精子活力=直線運(yùn)動精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

（3）精子質(zhì)膜完整率測定。采用低滲腫脹法（HOST）檢測精子質(zhì)膜完整性。將9.0 g果糖和4.9 g檸檬酸鈉溶于1 000 mL蒸餾水中配置成HOST低滲溶液。將10 μL精液加入100 μL 37 ℃預(yù)熱的HOST低滲溶液中，37 ℃孵育40 min，取10 μL精液涂于載玻片上，晾干后在200×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察4個視野，統(tǒng)計質(zhì)膜完整和不完整的精子。其中，精子尾部有卷曲或精子膨脹為質(zhì)膜完整精子;反之，則為質(zhì)膜不完整精子。精子質(zhì)膜完整率=膜完整精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

（4）精子頂體完整率測定。采用考馬斯亮藍(lán)法測定。將解凍后的100 μL精液加入500 μL 37 ℃預(yù)熱生理鹽水中，1 000 r/min 離心15 s后棄上清。加入500 μL多聚甲醛，室溫固定20 min，再次離心棄上清。通過PBS懸浮洗滌2次后，取10 μL樣品進(jìn)行涂片，經(jīng)空氣干燥后，滴加0.22%考馬斯亮藍(lán)染液，室溫靜置10 min。將染液洗滌干燥后，于油鏡下觀察頂體完整情況。每張抹片中觀察200個精子，并統(tǒng)計頂體完整的精子數(shù)。其中，頂體著色為均勻的藍(lán)色，代表頂體完整;反之，頂體著色淺或未染色，且邊緣不完整為頂體缺失或損壞。精子頂體完整率=頂體完整的精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

1.4? 統(tǒng)計分析

上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，當(dāng)P<0.05表示差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 比格犬鮮精品質(zhì)檢測結(jié)果

本試驗(yàn)共采集8只公犬的精液，進(jìn)行精液品質(zhì)檢測分析（表2）。其中1號、3號和6號的犬只精液檢測結(jié)果不符合后續(xù)試驗(yàn)要求。故選用2號、4號、5號、7號和8號犬為試驗(yàn)犬，采集精液后進(jìn)行精液冷凍與凍后分析。通過對合格的5只犬新鮮精液進(jìn)行品質(zhì)檢測，犬平均射精量為2.85 mL，密度為2.01×108個/mL，pH為6.56。

2.2? 不同糖類對犬精子冷凍保存效果的影響

稀釋液中不同糖類物質(zhì)對犬精子解凍后的精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性影響如表3所示。其中添加葡萄糖和果糖的稀釋液中精子解凍后活率最高，分別為59.21%±2.00%和59.90%±1.36%（P<0.05）;添加蔗糖和海藻糖精子解凍后活率較低，分別為49.52%±2.20%和49.52%±1.74%。通過檢測解凍后精子活力發(fā)現(xiàn)，僅添加蔗糖稀釋液的精子活力最低，為0.46%±0.01%，而稀釋液中添加其余4種糖類物質(zhì)的精子解凍后活力差異不顯著（P>0.05）。進(jìn)一步評估精子解凍后質(zhì)膜完整率，結(jié)果顯示添加果糖的稀釋液組質(zhì)膜完整率最高，為49.52%±2.12%，且與添加葡萄糖、乳糖和海藻糖差異不顯著（P>0.05），但添加蔗糖的精子質(zhì)膜完整率最低，為42.21%±2.68%（P<0.05）。通過對各組凍后精子頂體完整率檢測發(fā)現(xiàn)，添加果糖組最高，為48.20%±1.80%，而添加蔗糖組最低，為40.59%±2.38%。

3? 討論

精液冷凍稀釋液中糖類物質(zhì)作為非滲透性保護(hù)劑，在冷凍過程中能提高細(xì)胞外的滲透壓，從而避免細(xì)胞內(nèi)水分向外流出而造成細(xì)胞脫水而皺縮，也能進(jìn)一步減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，從而避免細(xì)胞遭受破壞[11]。此外，以往研究顯示稀釋液中糖類物質(zhì)的添加能減少甘油對精子的毒害作用，從而提高精子活率和頂體完整率[12]。

作為反映精子運(yùn)動狀態(tài)的重要指標(biāo)，精子活率直接影響精子的受精能力，從而影響受精率。目前，不同國家對于解凍后精子活率和活力的標(biāo)準(zhǔn)不同，發(fā)達(dá)國家普遍要求均為35%以上，我國對解凍后的精子活率和活力要求均為30%以上[13]。稀釋液中添加的5種糖類物質(zhì)后，犬精液解凍后精子活率和活力均超過國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)，說明5種糖類物質(zhì)的稀釋液均能保證犬精子解凍后的受精能力。其中，添加果糖的稀釋液中犬精子凍后活率最高，葡萄糖次之。較多研究已經(jīng)證明果糖和葡萄糖是精子的主要能量來源，但在犬的精液中沒有發(fā)現(xiàn)果糖和葡萄糖的存在。因此，外源性的添加果糖和葡萄糖能增加犬解凍后精子的能量代謝[13]。

精子質(zhì)膜是在精子冷凍和解凍過程中最易受損傷的部位，也是影響精子受精能力的重要因素之一。精子質(zhì)膜的完整性對精子維持自身新陳代謝、精子獲能和頂替反應(yīng)等能力有直接關(guān)系[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋液中添加不同糖類物質(zhì)對犬精子凍后的質(zhì)膜完整率效果依次為果糖>葡萄糖>海藻糖>乳糖>蔗糖。稀釋液中添加糖類物質(zhì)主要有兩方面作用，第一，糖類物質(zhì)能提高過氧化物酶的活性，防止細(xì)胞質(zhì)膜受到脂質(zhì)過氧化，從而保持細(xì)胞膜通透性的穩(wěn)定;第二，糖類物質(zhì)具有一定黏性，能黏附在精子外圍，形成一個微環(huán)境，減少冷凍過程中形成的冰晶，從而防止冰晶對細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞[15]。此外，有研究顯示，蔗糖在哺乳動物精液低溫保存中，必須和滲透性抗凍劑聯(lián)合使用才能有效保護(hù)精子，這也進(jìn)一步解釋了本試驗(yàn)中稀釋液添加蔗糖組精子解凍后質(zhì)膜完整性最低的原因[16]。

精子頂體中含有能影響精子受精能力的水解酶，若頂體結(jié)構(gòu)受損傷而破壞，造成水解酶的丟失，直接影響精子的受精能力。保持精子完整性也是精子能夠完成頂體反應(yīng)、穿過透明帶的必要前提[17]。目前，已經(jīng)證明精子受到低溫應(yīng)激后，會出現(xiàn)頂體異常，造成頂體完整率降低，一定程度上影響了精子的冷凍保存效果[18]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，稀釋液中添加不同糖類物質(zhì)對犬精子凍后的質(zhì)膜完整率效果依次為果糖>乳糖>葡萄糖>海藻糖>蔗糖。以往研究顯示，精液稀釋液中添加糖類物質(zhì)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)其能增加細(xì)胞膜流動性，從而令精子頂體完整率得到提升[19]。本研究結(jié)果顯示，添加果糖組的精子凍后頂體完整率顯著高于蔗糖組，進(jìn)一步說明果糖作為犬精液稀釋液相對于蔗糖更加具有優(yōu)勢。

綜上所述，不同糖類物質(zhì)對犬精子的冷凍保存具有不同程度的影響，綜合解凍后犬精子的活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性檢測結(jié)果，果糖作為犬的精液冷凍稀釋液是最佳的。

參考文獻(xiàn)：

[1] SALMON V M，LECLERC P，BAILEY J L. Novel technical strategies to optimize cryopreservation of goat semen using cholesterol-loaded cyclodextrin[J].Cryobiology，2017，74：19-24.

[2] 郝志明，雷? 磊.發(fā)情前期和發(fā)情期格力犬的血清孕酮水平及其適配期的凍精人工授精[J].中國獸醫(yī)雜志，2018，54（3）：30-32.

[3] 潘壽文，劉? 湖，馬大君，等.犬的精液冷凍技術(shù)[J].畜牧與獸醫(yī)，1986（3）：25-30.

[4] 禹學(xué)禮，栗穎華.犬顆粒凍精人工授精的試驗(yàn)[J].黑龍江動物繁殖，1997（1）：10-11.

[5] 李彩霞.犬精液保存稀釋液和溫度的篩選及凍精品質(zhì)評定的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] 曹授俊，雷莉輝，胡? 平，等.犬精液冷凍保存條件的優(yōu)化[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（5）：148-150.

[7] 王素梅，孫耀輝，秦光彪，等.犬精液冷凍稀釋液配方優(yōu)化試驗(yàn)[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物，2015（4）：10-12.

[8] 沈留紅，楊慶穩(wěn)，曹隨忠.犬精液冷凍液的優(yōu)化試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2012（48）：27-29.

[9] CATURLA-SáNCHEZ E，SáNCHEZ-CALABUIG M J，PéREZ-GUTIéRREZ J F，et al. Vitrification of dog spermatozoa：Effects of two cryoprotectants（sucrose or trehalose） and two warming procedures[J].Cryobiology，2018，80：126-129.

[10] YAMASHIRO H，NARITA K，SUGIMURA S，et al. Trehalose enhanced the freezability of Poodle dog sperm collected by an artificial vagina（AV）[J].Animal reproduction science，2007， 102（1-2）：165-171.

[11] 南向斌.三種多糖和冷凍平衡時間對牛精液冷凍效果影響的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[12] 張樹山，李青旺，李? 剛，等.海藻糖、蔗糖和乳糖對豬精液冷凍保護(hù)效果的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006（6）：41-45，51.

[13] Ponglowhapan S，Birgitta Essén-Gustavsson，F(xiàn)orsberg C L. Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen[J].Theriogenology，2004， 62（8）：165-171.

[14] 牟珍妮，孫振高，劉紅根，等.精子獲能通路的最新研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2018，26（8）：1-4.

[15] 何? 濤.三種多糖對豬精子冷凍保存效果的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[16] 張? 婷.四種糖類對豬精液冷凍保存效果的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[17] PENZIAS A S. The Physiology of Reproduction，vols 1 & 2[J]. The journal of the american medical association，1994，272（19）：1552.

[18] 禹學(xué)禮.豫西土犬精液冷凍與人工授精的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003.

[19] 謝東淇.茶多酚和殼聚糖對豬精液常溫保存效果的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

收稿日期：2020-04-20

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃[滬農(nóng)青字（20l8）第l-22號]

作者簡介：孫玲偉（1987-），女，黑龍江伊春人，助理研究員，博士，主要從事動物繁殖學(xué)研究，（電話）17740813839（電子信箱）

sunlingwei1987@126.com;通信作者，張德福（1963-），男，上海奉賢人，研究員，博士，主要從事動物繁殖生物技術(shù)研究，

（電話）021-52235475（電子信箱）zhangdefuzdf@163.com。