觀察環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體對(duì)燒傷感染小鼠的治療作用

張歡歡

【摘要】目的 觀察燒傷感染小鼠環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體的治療作用。方法 購(gòu)買鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康雌性SPF級(jí)ICR小鼠，建立燒傷感染模型，觀察噬菌體療效，分析滅活噬菌體的治療作用、非宿主菌感染小鼠噬菌體的治療作用，研究噬菌體體內(nèi)代謝，然后分離鑒定噬菌體，確定細(xì)菌最小致死劑量，分析噬菌體Pap-co1治療效果的時(shí)間依賴性、滅活噬菌體Pap-co1療效、Pap-co2燒傷感染小鼠噬菌體的治療作用。結(jié)果 對(duì)燒傷小鼠進(jìn)行感染，途徑為稀釋新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌Pap-co1為1×103-1×108PFU/ml，然后將第2 d、5 d小鼠的生存率選取出來(lái)，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml劑量組小鼠均死亡，因此絕對(duì)最小致死劑量為1×106CFU/ml。滅活噬菌體組、對(duì)照組小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均顯著低于正常噬菌體組100.0%、100.0%（P<0.05），但滅活噬菌體組、對(duì)照組小鼠第2 d、5 d的生存率之間的差異均不顯著（P>0.05）。Pap-co2組、對(duì)照組小鼠第2 d、5 d生存率60.0%、0，80.0%、0均顯著低于Pap-co1組100.0%、100.0%（P<0.05），但Pap-co2組、對(duì)照組小鼠第2 d、5 d生存率之間的差異均不顯著（P>0.05）。給予小鼠腹腔注射噬菌體Pap-co1后第一時(shí)間被吸收，1h內(nèi)達(dá)到最高峰，24h內(nèi)維持噬菌體濃度在104左右，維持在一定濃度范圍內(nèi)一定時(shí)間后逐漸降低。結(jié)論 燒傷感染小鼠環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌寬噬噬菌體的治療作用明顯，同時(shí)具有較低的抗原性。

【關(guān)鍵詞】環(huán)境中分離;銅綠假單胞菌;噬菌體;燒傷感染小鼠;治療作用

【中圖分類號(hào)】R644 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2020.21..02

在醫(yī)院感染病原菌中，銅綠假單胞菌占有重要地位，在呼吸科革蘭陰性菌中位居首位。近年來(lái)，銅綠假單胞菌耐藥性在大量應(yīng)用各種廣譜抗菌藥的作用下日益提升。在我國(guó)，在所有醫(yī)院感染革蘭陰性桿菌中，銅綠假單胞菌位居首位，對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性已經(jīng)在30%以上，具有極為復(fù)雜的耐藥機(jī)制。相關(guān)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[1]，合并銅綠假單胞菌感染的死亡燒傷患者占總數(shù)的50%。因此，臨床很有必要深入研究噬菌體療法這一抗感染治療方法。本研究觀察了燒傷感染小鼠環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

購(gòu)買上海新興化工試劑研究所生產(chǎn)的瓊脂粉，杭州天和廠生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，Amersco公司生產(chǎn)的CsCl，自行配置LB培養(yǎng)液;河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科分離并鑒定的21株銅綠假單胞菌;從龍湖鎮(zhèn)居民生活用水下水道中分離噬菌體，經(jīng)噬菌斑、電鏡觀察鑒定。擴(kuò)增培養(yǎng)噬菌體后離心，途徑為經(jīng)CsCl密度梯度，并純化、生理鹽水稀釋，對(duì)滴度進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中將噬菌斑充分利用起來(lái)，稀釋到1×1010PFU/ml待用，稀釋過(guò)程中將生理鹽水充分利用起來(lái);購(gòu)買鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康雌性SPF級(jí)ICR小鼠，周齡6～8周，平均（7.0±1.0）周;體重18-22g，平均（20.0±2.0）g。

1.2 方法

1.2.1 燒傷感染模型建立

在10 ml LB培養(yǎng)液中按1：100比例稀釋新鮮培養(yǎng)的銅綠假單胞菌，繼續(xù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，濃度為1×108CFU/ml，A50為0.5左右。分實(shí)驗(yàn)小組為7組，每組5只，將其背部毛剃掉，面積為小鼠體表面積的10%，直徑為2.5 cm的圓形，讓小鼠吸入乙醚對(duì)其進(jìn)行麻醉，待其無(wú)足趾反射后在鼠夾上固定小鼠，用90℃的熱水將其燙傷，持續(xù)10 s，為了對(duì)燙傷引發(fā)的體液丟失進(jìn)行補(bǔ)充，將0.1 ml不同濃度的銅綠假單胞菌皮下注射到燒傷部位，同時(shí)給予其皮下注射0.5 ml生理鹽水，將燒傷感染模型建立起來(lái)，給予對(duì)照組注射等量生理鹽水，對(duì)小鼠進(jìn)行5 d觀察，將最小致死劑量（LD100）設(shè)定為1組小鼠全部死亡的最小劑量，并將其設(shè)定為燒傷動(dòng)物模型的感染劑量。

1.2.2 噬菌體療效觀察

分實(shí)驗(yàn)小鼠為6組，每組5只，開始計(jì)時(shí)時(shí)間為建立燒傷感染模型后，感染后即刻、3 h、6 h、12 h、24 h分別給予其腹腔注射0.1 ml效價(jià)為1×1010PFU/ml的噬菌體。每組均將對(duì)照組設(shè)置出來(lái)，給予其注射等劑量生理鹽水，將小鼠生存率記錄下來(lái)。

1.2.3 滅活噬菌體的治療作用分析

加熱噬菌體30 min，條件為在90℃的溫度下，效價(jià)為1×1010PFU/ml，滅活。分實(shí)驗(yàn)小鼠為3組，每組5只，分別給予其注射0.1 ml噬菌體、滅活噬菌體、給予其注射等量生理鹽水（對(duì)照組），時(shí)間為燒傷感染后即刻。

1.2.4 非宿主菌感染小鼠噬菌體的治療作用分析

分實(shí)驗(yàn)小鼠為3組，分別給予其注射0.1 ml生理鹽水+0.1 ml該噬菌體宿主菌（對(duì)照組）、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主菌、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主譜以外的銅綠假單胞菌，時(shí)間為燒傷后，將小鼠生存率記錄下來(lái)。

1.2.5 噬菌體體內(nèi)代謝研究

給予實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射1 ml高濃度噬菌體，時(shí)間為開始計(jì)時(shí)前，分別在第1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h將血液從小鼠斷尾取出，對(duì)噬菌體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中運(yùn)用噬菌斑法，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，將濃度時(shí)間曲線繪制出來(lái)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料用率表示，用x2檢驗(yàn)。采用SPSS 21.0，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體分離鑒定

將宿主菌設(shè)定為銅綠假單胞菌，將3株銅綠假單胞菌噬菌體從下水道中分離出來(lái)，其中寬噬噬菌體1株，電鏡觀察為短尾噬菌體，直徑、尾長(zhǎng)分別為45 nm、50 nm，裂解譜、噬菌斑大小分別為6株銅綠假單胞菌、2 mm，命名其為Pap-co1，將1株從6株宿主菌、宿主譜以外的銅綠假單胞菌選取出來(lái)，分別命名為Pap-co1、Pap-co2，，在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用。