γ-干擾素釋放試驗聯(lián)合斑點形成細胞及ELISPOT診斷活動性結核與潛伏性結核的研究

李玉美　陳胤文　余曉琳　洪建明　林炳耀　曾今誠　林東子

【摘要】 目的：探究γ-干擾素釋放試驗（interferon-γ release assays，IGRAs）聯(lián)合可產生γ-干擾素（interferon-γ，INF-γ）的斑點形成細胞（spot-forming cells，SFC）數量、酶聯(lián)免疫斑點檢測法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）模型識別活動性結核與潛伏性結核的診斷效能。方法：選取2017年9月-2018年12月在筆者所在醫(yī)院就診的結核分枝桿菌感染患者312例，其中活動性肺結核組154例記為活動組，潛伏性結核分枝桿菌感染158例記為潛伏組。通過受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析γ-干擾素釋放試驗、SFC及ELISPOT聯(lián)合診斷模型識別活動性及潛伏性結核的診斷價值。結果：活動組γ-干擾素釋放試驗結果高于潛伏組，SFC高于潛伏組，ELISPOT陽性率（78.6%）高于潛伏組（31.0%），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。γ-干擾素釋放試驗診斷的臨界值為2.72 IU/ml，其對應靈敏度為79.1%，特異度為52.5%，ROC曲線下面積為0.768[95%CI（0.708，0.829）];SFC診斷臨界值為2.78，其對應的靈敏度為75.3%，特異度為60.8%，ROC曲線下面積為0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT陽性診斷臨界值為4.27 mg/L，其對應靈敏度為70.8%，特異度為51.3%，ROC曲線下面積為0.620[95%CI（0.546，0.694）]。行Logistic回歸分析，得到聯(lián)合診斷模型Logit（P）=1.433+2.512γ-干擾素釋放試驗+1.654 SFC+1.121 ELISPOT，聯(lián)合檢測截斷值為2.47，對應靈敏度為74.7%，特異度為80.4%，ROC曲線下面積為0.851[95%CI（0.806，0.896）]。聯(lián)合檢測特異度及曲線下面積均高于各指標單獨檢測，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且聯(lián)合檢測保持較好的靈敏度。結論：γ-干擾素釋放試驗、SFC及ELISPOT聯(lián)合診斷模型可提高活動性結核的特異度，并保持較高的靈敏度，在鑒別活動性及潛伏性結核感染方面具有重要的臨床價值。

【關鍵詞】 活動性結核病 γ-干擾素釋放試驗 酶聯(lián)免疫斑點檢測法 斑點形成細胞 聯(lián)合診斷

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.21.006 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）21-00-04

Diagnostic Value of Interferon-γ Release Assays Combined with Spot-forming Cells and Enzyme-linked Immunospot Assay in Active and Latent Tuberculosis/LI Yumei， CHEN Yinwen， YU Xiaolin， HONG Jianming， LIN Bingyao， ZENG Jincheng， LIN Dongzi. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（21）： 14-17

[Abstract] Objective： To explore the diagnostic value of Spot-forming cells （SFC） and enzyme linked immunospot assay （ELISPOT） in combination with interferon-γ release assays （IGRAs） in active and latent tuberculosis. Method： A total of 312 patients with mycobacterium tuberculosis infection who visited our hospital from September 2017 to December 2018 were selected. Among them， 154 patients in the active tuberculosis group and 158 patients with latent mycobacterium tuberculosis infection were recorded as the latent group. The diagnostic value of IFN-γ release test， SFC and ELISPOT combined diagnostic model in active and latent tuberculosis was analyzed by ROC curve. Result： The result of IFN-γ release test in the active group was higher than that in the latent group， the level of SFC in the active group was higher than that in the latent group， the positive rate of ELISPOT in the active group （78.6%） was higher than that in the latent group （31.0%）， the differences were statistically significant （P<0.05）. The diagnostic threshold of IFN-γ release test was 2.72 IU/ml， the corresponding sensitivity was 79.1%， the specificity was 52.5%， and the area under ROC curve was 0.768 [95%CI （0.708， 0.829）]. The diagnostic threshold of SFC diagnosis was 2.78， the corresponding sensitivity was 75.3%， the specificity was 60.8%， and the area under ROC curve was 0.768 [95%CI （0.711， 0.825）]. The diagnostic threshold of positive diagnosis of ELISPOT was 4.27 mg/L， the corresponding sensitivity was 70.8%， the specificity was 51.3%， and the area under ROC curve was 0.620 [95%CI （0.546， 0.694）]. The combined diagnosis model Logit （P）=1.433+2.512 γ-interferon release test+1.654 SFC+1.121 was obtained by logistic regression analysis， and the diagnostic threshold of combined diagnosis model was 2.47， and the sensitivity of it was 74.7%， the specificity was 80.4%， and the area under ROC curve was 0.851 [95%CI （0.806， 0.896）]. The specificity and the area under the curve of combined detection were higher than those of individual detection， the differences were statistically significant （P<0.05）， and the combined detection maintained good sensitivity. Conclusion： IFN-γ release test， SFC and ELISPOT combined diagnosis model can improve the specificity of active tuberculosis， and maintain high sensitivity， which has important clinical value in distinguishing active and latent tuberculosis infection.

[Key words] Active tuberculosis Interferon-γ release assays Enzyme-linked immunospot assay Spot-forming cells Combination diagnosis

First-authors address： The Sixth Peoples Hospital， Dongguan 523008， China

近年來，隨著經濟的發(fā)展，人口遷徙空前加快，增加了結核病的傳播機會[1]，據報道，中國的結核分枝桿菌攜帶者的比例為13%～20%[2]。如果不經治療，其中約5%的結核菌攜帶者將發(fā)展為活動性結核病[3]。雖然當前有多種檢測結核病的方法，但是靈敏度和特異性還不能滿足臨床的要求[4]。γ-干擾素（IFN-γ）釋放試驗是一種新的用于輔助診斷結核感染的免疫學方法，其靈敏度和特異性均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法，使其在臨床上得以廣泛應用[5]。然而，IFN-γ釋放試驗（interferon-γrelease assays，IGRAs）不可區(qū)分活動性結核病和潛伏性結核分枝桿菌感染[6]。由于抗結核治療有副作用，準確識別活動性結核病和潛伏性結核分枝桿菌感染對臨床上決定是否采取治療措施十分重要。本研究擬綜合使用IFN-γ釋放水平及產生γ-干擾素的T細胞數量即斑點形成細胞（sport-forming cells，SFC）、酶聯(lián)免疫斑點檢測法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）來建立一個模型，來用于活動性結核病和潛伏性結核分枝桿菌感染的識別，探討其臨床可行性，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月-2018年12月在筆者所在醫(yī)院就診的結核分枝桿菌感染患者312例，其中活動性肺結核組154例記為活動組，潛伏性結核分枝桿菌感染158例記為潛伏組?；顒咏M納入標準：抗酸染色檢測、結核分枝桿菌PCR檢測或分枝桿菌培養(yǎng)檢測陽性;且有明顯結核相關癥狀?；顒咏M排除標準：已進行2周以上抗結核治療;依從性差、復診或隨訪困難;年齡小于16歲或大于65歲;妊娠期;合并肺外結核?。ńY核性胸膜炎除外）;抗酸染色（+）但PCR（-），懷疑為非結核分枝桿菌感染;人類免疫缺陷病毒感染。潛伏組納入標準：與活動性結核患者密切接觸，結核菌素實驗陽性，但無咳嗽、咳痰、發(fā)熱、盜汗等臨床表現(xiàn)，同時無影像學證據支持肺結核診斷。潛伏組排除標準：依從性差、復診或隨訪困難;年齡小于16歲或大于65歲;妊娠期;不明原因的感染性疾，包括懷疑為非結核分枝桿菌感染及HIV感染;自身免疫性疾病;有結核病史;ICU病房患者及腫瘤患者;使用免疫抑制劑;人類免疫缺陷病毒感染?；顒咏M男88例，女66例，平均年齡（57.12±10.74）歲;潛伏組男89例，女69例，平均年齡（59.43±11.28）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（字2=0.020，P=0.885;t=0.852，P=0.065）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審閱同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法與觀察指標

γ-INF釋放試驗：入組后抽取患者外周靜脈血3 ml，肝素管抗凝，在空白對照管N，測試管T和陽性對照管P各加入1 ml全血樣本（管經肝素抗凝處理），在血液采集4 h內將各管放入（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，后以3 000～5 000 r/min的轉速離心10 min，取血漿檢測各培養(yǎng)管中γ-干擾素的濃度。高于診斷最佳截斷值，則定位陽性。

ELISPOT及SFC測定：入組后抽取患者外周靜脈血3 ml，肝素管抗凝，分離外周血單個核細胞并測定細胞濃度，測定經分泌靶抗原-6及培養(yǎng)濾液蛋白-10融合蛋白刺激下產生γ-INF的T-細胞數量（即SFC），與陰性對照孔相比，得出ELISPOT陽性率。判定標準：ELISPOT陽性率，每孔20萬單個核細胞的陰性對照孔斑點數為0～5時，則測試孔SFC與對照孔SFC之差≥6為陽性;若陰性對照孔斑點數≥6，則測試孔SFC的值大于2倍對照孔SFC的值為陽性。ELISPOT分析儀為德國Autoimmun diagnostika公司生產，γ-INF ELISPOT試劑盒操作嚴格按照操作標準（批號：1605023，上海江萊生物科技有限公司產）。

1.3 統(tǒng)計學處理

數據處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，采用獨立資料t檢驗;不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，采用Mann-Whitney U檢驗;計數資料以率（%）表示，比較用字2檢驗。運用Logistic回歸擬合聯(lián)合診斷模型并繪制ROC曲線評估診斷價值，采用Hanley-McNeil方法比較ROC曲線下面積，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組γ-干擾素、SFC及ELISPOT陽性率比較

活動組γ-干擾素釋放試驗結果高于潛伏組，SFC高于潛伏組，ELISPOT陽性率（78.6%）高于潛伏組（31.0%），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 各組γ-干擾素釋放水平、SFC及ELISPOT結果單獨和聯(lián)合診斷效能比較

以血清γ-干擾素釋放水平、SFC及ELISPOT陽性結果作為檢驗變量，有無活動性結核病為狀態(tài)標量，以1-特異度為X軸，以靈敏度為Y軸繪制ROC曲線，見圖1，以確定最佳截斷值。根據ROC曲線可得，γ-干擾素釋放試驗診斷的臨界值為2.72 IU/ml，其對應的靈敏度為79.1%，特異度為52.5%，ROC曲線下面積為0.768[95%CI（0.708，0.829）];SFC診斷的臨界值為2.78，其對應的靈敏度為75.3%，特異度為60.8%，ROC曲線下面積為0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT陽性診斷的臨界值為4.27 mg/L，其對應的靈敏度為70.8%，特異度為51.3%，ROC曲線下面積為0.620[95%CI（0.546，0.694）];隨后以活動性結核的發(fā)生情況（賦值：發(fā)生=1，未發(fā)生=0）為因變量，以γ-干擾素釋放水平、SFC及ELISPOT陽性結果為自變量，進行Logistic回歸分析，得到回歸方程為Logit （P）=1.433+2.512γ-干擾素釋放試驗+1.654 SFC+1.121 ELISPOT，模型中概率值變量pre-1=1/{1+exp[-Logit （P）]}，并根據Logistic回歸模型中的概率值pre-1擬合聯(lián)合ROC曲線，聯(lián)合檢測最佳診斷截斷值為2.47，靈敏度為74.7%，特異度為80.4%，ROC曲線下面積為0.851[95%CI（0.806，0.896）]。聯(lián)合檢測特異度及曲線下面積均高于各指標單獨檢測，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且聯(lián)合檢測保持較好的靈敏度，見表2、表3。

3 討論

我國是結核大國，結核感染率在世界排名第二位，結核的藥物治療對機體損傷較大，因此需要建立高效的診斷方法進行活動性結核及潛伏性結核的鑒別[7]。γ-干擾素釋放實驗是臨床上確認結核感染和評估較為常用的方法，能較為靈敏和準確地鑒定結核的感染，但是在區(qū)分潛伏性結核和活動性結核方面尚存在不足，需要探索更好地鑒別診斷方法[5]。既往研究中SFC及ELISPOT陽性率在鑒別潛伏性結核和活動性結核顯示出一定成效[8-9]，本研究探討了γ-干擾素釋放試驗、SFC及ELISPOT聯(lián)合診斷模型鑒別活動和潛伏結核病的臨床價值。

γ-干擾素釋放試驗是一種較新的結核病診斷方法，通過抗原刺激致敏淋巴細胞產生的干擾素水平來確定是否有結核分枝桿菌的感染[10]。在本實驗中，γ-干擾素釋放試驗診斷的靈敏度為79.1%，特異度為52.5%，ROC曲線下面積為0.768[95% CI（0.708，0.829）]。謝莉等[11]研究表明γ-干擾素釋放試驗診斷活動性結核的敏感度和特異度分別為84%、62%，高于本實驗;但兩者樣本人群、樣本量存在較大差異。本實驗中γ-干擾素釋放試驗在鑒別潛伏性和活動性結核方面價值有限，主要是特異度較低，單一診斷依據可能造成誤診，使一部分患者接受了結核治療對機體產生危害。因此，γ-干擾素釋放試驗作為單一的診斷依據價值有限，需要和其他方法相結合提高診斷效能。

ELISPOT是采用干擾素釋放試驗技術，通過測定抗原刺激下產生干擾素的斑點數量，以此判斷是否結果為陽性;并同時確定SFC的數量[12]。在活動性結核中，機體受到結核分枝桿菌的抗原刺激較多，免疫系統(tǒng)較為活躍，可產生較多的致敏T細胞，這是其鑒別活動性結核和潛伏性結核的理論基礎[13]。在本實驗中，SFC診斷的靈敏度為75.3%，特異度為60.8%，ROC曲線下面積為0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT陽性診斷的靈敏度為70.8%，特異度為51.3%，ROC曲線下面積為0.620[95%CI（0.546，0.694）]，兩種方法靈敏度較好。史會影等[14]研究了ELISPOT實驗診斷活動性結核的效能，敏感性及特異性均達80%，與本研究結果相比較高，可能是由于樣本人群結核感染情況存在一定差異。SFC及ELISPOT是診斷活動性結核的重要方法，靈敏度尚可，但單獨診斷價值有限，需要聯(lián)合其他方法提高診斷特異度，以減少誤診情況。

既往研究表明聯(lián)合多種方法診斷活動性結核提高其檢出率[15-16]。在本實驗中，三者聯(lián)合診斷活動性結核的靈敏度為74.7%，特異度為80.4%，ROC曲線下面積為0.851（95%CI 0.806，0.896）。聯(lián)合檢測特異度顯著高于各指標單獨檢測（P<0.05），且保持較好的靈敏度，聯(lián)合診斷的曲線下面積顯著高于各項指標單獨檢測（P<0.05）。表明聯(lián)合診斷可提高活動性結核病的診斷準確度，具有較好的臨床應用前景。通過構建γ-干擾素釋放試驗、SFC及ELISPOT聯(lián)合診斷模型提高了活動性結核診斷的特異度，也明顯提高了診斷效能。

綜上所述，γ-干擾素釋放試驗、SFC及ELISPOT聯(lián)合診斷模型可提高活動性結核的特異度，并保持較高的靈敏度，在鑒別活動性及潛伏性結核感染方面具有重要的臨床價值。

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（收稿日期：2020-04-24） （本文編輯：馬竹君）