華金仁 鄭 芳 程慧明 潘 玫
江西省婦幼保健院,江西省南昌市 330006
葡萄胎是一種常見(jiàn)良性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病,存在惡變傾向,臨床極易因治療不當(dāng)或其他因素,致使葡萄胎轉(zhuǎn)變?yōu)榻q毛膜癌或侵蝕性葡萄胎,影響患者生命健康[1]。目前認(rèn)為,妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤一個(gè)重要特征為腫瘤細(xì)胞破壞力強(qiáng)、經(jīng)血行轉(zhuǎn)移時(shí)間早,故早期預(yù)防、治療葡萄胎惡變至關(guān)重要[2]。葡萄胎惡變影響因素較多,包括年齡、孕次、先行妊娠間隔時(shí)間等。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)印跡基因可經(jīng)單親傳遞某些遺傳性狀,對(duì)胎兒及胎盤(pán)正常發(fā)育、細(xì)胞分化及增殖產(chǎn)生影響[3]。而胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)基因?qū)儆谟≯E基因研究史上最早被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印跡基因。H19是目前唯一發(fā)現(xiàn)的不表達(dá)蛋白質(zhì)而在mRNA水平上發(fā)揮作用的印跡基因。目前,臨床就葡萄胎惡變與印跡基因H19和IGF2表達(dá)相關(guān)性研究仍較少。本研究重點(diǎn)分析了葡萄胎惡變與印跡基因H19和IGF2表達(dá)的關(guān)系,報(bào)道如下。
1.1 一般資料 隨機(jī)選取2016年9月—2018年9月本院78例葡萄胎患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]中葡萄胎診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)胸片、B超或術(shù)后病理等檢查確診為良性葡萄胎;(2)可獲得首次清宮新鮮葡萄胎組織;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有清宮術(shù)史;(2)葡萄胎排出前存在陰道轉(zhuǎn)移或肺轉(zhuǎn)移;(3)有家族性葡萄胎史。其中,年齡20~39歲,平均年齡(28.21±6.23)歲;孕次1~4次,平均孕次(2.85±0.74)次;產(chǎn)次0~3次,平均產(chǎn)次(1.26±0.64)次;完全性葡萄胎28例,部分性葡萄胎50例。
1.2 方法
1.2.1 儀器與試劑:儀器包括日本Thermo公司提供的臺(tái)式低溫微量高速離心機(jī)、江蘇蘇州凈化設(shè)備廠提供的超凈工作臺(tái)、美國(guó)Bio-Rad公司提供的分光光度儀及PCR儀、德國(guó)Sartorius公司提供的凝膠成像系統(tǒng)等。試劑包括上海金穗生物有限公司提供的無(wú)水乙醇、南京金斯瑞生物科技有限公司提供的H19、IGF2引物等。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法:取25~50mg新鮮葡萄胎組織,以1ml DNAiso Reagent滴入,勻漿,至無(wú)塊狀沉淀,室溫下靜置5min。離心,10min,取上清液。加入DNAiso Reagent 1/2體積量無(wú)水乙醇,觀察出現(xiàn)云霧狀DNA沉淀,倒出上清液,離心管底部留DNA沉淀。以75%乙醇1ml滴入,上下顛倒,離心,棄乙醇。去乙醇后基因組DNA沉淀室溫下干燥,持續(xù)30s;滅菌水溶解,置于-80℃冰箱備用。以分光光度儀檢測(cè)DNA濃度(OD 260nm×50×0.04)、純度(OD 260nm/OD 280nm)。設(shè)計(jì)H19、IGF2引物,經(jīng)BLASH驗(yàn)證。H19 PCR反應(yīng)儀95℃預(yù)變形,持續(xù)5min;95℃變性,持續(xù)30s;61℃退火,持續(xù)30s;72℃延伸,持續(xù)10s。共35個(gè)循環(huán),4℃。IGF2 PCR反應(yīng)儀95℃預(yù)變形,持續(xù)5min;95℃變性,持續(xù)30s;58℃退火,持續(xù)30s;72℃延伸,持續(xù)10s。共35個(gè)循環(huán),72℃延伸,持續(xù)5min,4℃?;靹?μl 6×DNA上樣緩沖液、5μl PCR液,上樣于3%瓊脂糖凝膠,電泳,EB染色,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。H19陽(yáng)性為出現(xiàn)397bp擴(kuò)增條帶,僅出現(xiàn)397bp為a型等位基因表達(dá),僅出現(xiàn)168bp或229bp為b型等位基因表達(dá),出現(xiàn)397bp、168bp、229bp為ab型等位基因表達(dá)。IGF2陽(yáng)性為出現(xiàn)236bp擴(kuò)增條帶,僅出現(xiàn)236bp為a型等位基因表達(dá),僅出現(xiàn)173bp為b型等位基因表達(dá),出現(xiàn)236bp、173bp為ab型等位基因表達(dá)。
1.2.3 隨訪:清宮術(shù)后每隔3個(gè)月隨訪1次,共12個(gè)月。觀察葡萄胎惡變率,惡變采用有無(wú)陰道異常流血、婦科檢查、胸片、盆腔彩超等檢查確診。隨訪結(jié)束時(shí),惡變19例,未惡變59例。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS20.0軟件分析所得數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)對(duì)比。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 H19基因在葡萄胎組織中等位基因表達(dá) 兩組H19DNA基因型、RNA等位基因表達(dá)對(duì)比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 H19基因在葡萄胎組織中等位基因表達(dá)分析[n(%)]
2.2 IGF2基因在葡萄胎組織中等位基因表達(dá) 兩組IGF2DNA基因型、RNA等位基因表達(dá)對(duì)比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。
表2 IGF2基因在葡萄胎組織中等位基因表達(dá)分析[n(%)]
妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病在臨床上較為常見(jiàn),主要源自胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞,且涉及類(lèi)型較多,包括葡萄胎、胎盤(pán)部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等,其中葡萄胎最為常見(jiàn)。葡萄胎雖屬于良性病變,但也存在一定惡變傾向。據(jù)調(diào)查,50%左右絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎由葡萄胎惡變所致[5],而早期預(yù)測(cè)、診斷葡萄胎惡變,對(duì)指導(dǎo)治療方案制定,改善預(yù)后,具有重要價(jià)值[6]。印跡基因是僅表達(dá)某一親本來(lái)源的等位基因,在遺傳性疾病、腫瘤發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮一定作用。
H19、IGF2為目前被較好認(rèn)知的印跡基因類(lèi)型,屬同一個(gè)基因印跡群。其中,H19基因?qū)儆谀冈葱杂≯E基因,有一酶切位點(diǎn)RSAI,而IGF2屬于父源性印跡基因,有一酶切位點(diǎn)APAI。當(dāng)樣本為純合子時(shí),較難準(zhǔn)確鑒別是單等位基因表達(dá)還是雙等位基因表達(dá),故臨床采用RFLP技術(shù)進(jìn)行印跡狀態(tài)研究時(shí),需先明確基因型,選取雜合子,以確定基因印跡表達(dá)。目前認(rèn)為,印跡基因表達(dá)改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展中有一定作用,而基因甲基化是影響基因印跡改變的重要因素,多出現(xiàn)在生殖細(xì)胞分裂時(shí)。但臨床就葡萄胎惡變中H19、IGF2表達(dá)改變有無(wú)關(guān)聯(lián)仍無(wú)明確結(jié)論,且相關(guān)研究較少。本研究就該問(wèn)題進(jìn)行分析,自表1、表2可以看出,葡萄胎惡變與未惡變患者兩種印跡基因DNA基因型、RNA等位基因表達(dá)均無(wú)顯著差異,推測(cè)H19、IGF2基因表達(dá)與葡萄胎惡變無(wú)明顯相關(guān)性,但本研究并未明確相關(guān)具體機(jī)制,今后仍需加大研究力度,進(jìn)行更深層次調(diào)查分析。
綜上所述,H19、IGF2基因表達(dá)與葡萄胎惡變無(wú)明顯相關(guān)性,但相關(guān)具體機(jī)制仍未明確,今后仍需大量研究。