Rac1與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系的研究進展

朱包良，湯海博，欒紹齋，蔡建明

(1.海軍軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系艦船輻射醫(yī)學防護教研室，上海 200433； 2.海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院學員五大隊15隊，上海 200433； 3.解放軍71239部隊93分隊，遼寧 營口115003)

既往對Ras同源物GTP酶(Ras homologue guanosine triphosphate enzyme，Rho GTP酶)的認識僅限于其在調節(jié)肌動蛋白細胞骨架方面的重要作用。隨著研究的深入，越來越多的證據顯示Rho GTP酶的激活與癌基因之間有多種聯系[1]。Rho GTP酶主要參與細胞極化、運動、侵襲、增殖、凋亡、轉錄、細胞周期、細胞骨架、細胞間黏附以及活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產物形成等生理活動[2]。Ras相關C3肉毒毒素亞基1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)作為Rho GTP酶中最經典的成員受到廣泛關注。Rac1除了參與細胞骨架重組、板狀偽足形成以及影響正常細胞間的黏附外，還與腫瘤存在密切聯系。郭世洲等[3]發(fā)表的Rac1與腫瘤相關的研究表明，Rac1與少數腫瘤(如乳腺癌、肝癌和胃腸道腫瘤)的發(fā)生、侵襲、凋亡以及心血管形成有關。隨著對Rac1研究的深入，研究者發(fā)現其他腫瘤與Rac1的異常也有關[4-6]。例如，新發(fā)現的腫瘤(如宮頸癌[7]、鼻咽癌[8])與Rac1介導的信號通路異常有關；既往研究過的腫瘤更是明確了某些亞型(如三陰性乳腺癌[9]、非小細胞肺癌[10])與Rac1表達異常升高有關；同時部分機制也更加明確，已經確定了某些特定腫瘤與Rac1高活性突變體有關[11]。現就Rac1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系的研究進展予以綜述。

1 Rac1的生理基礎

小GTP酶Ras超家族含5個亞組，即Ras、Rho、Rab、Ran和Arf。哺乳動物共有20種Rho GTP酶，可分為兩大類：7種經典Rho GTP酶(RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3和Cdc42)；13種非經典Rho GTP酶(TC10、TCL、Chp1、Chp2、RhoG、Rnd1、Rnd2、Rnd3、RhoBTB1、RhoBTB2、RhoD、Rif和TTF[12])(圖1)。Rac1是Rho GTP酶的經典成員之一，其基因存在于第7號染色體(7p22)上，由7個長度超過29 kB的外顯子構成；Rac1的選擇性剪切變異體Rac1b包含一個額外的外顯子3b，是一種主要在結腸癌和乳腺癌中表達的本構活性突變體，即Rac1b處于持續(xù)激活狀態(tài)[13-14]。

Rac1：Ras相關C3肉毒毒素亞基1

Rac1作為一種分子開關有兩種狀態(tài)，即與GTP結合的激活態(tài)和與鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結合的失活態(tài)。在鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP酶啟動蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)和鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子(guanine nucleotide dissociation inhibitors，GDIs)3種分子的調節(jié)下，Rac1在激活態(tài)(與GTP結合)和失活態(tài)(與GDP結合)之間循環(huán)[15](圖2)。失活態(tài)Rac1-GDP在GEFs作用下生成激活態(tài)Rac1-GTP，激活態(tài)Rac1-GTP在GAPs作用下水解為失活態(tài)Rac1-GDP，胞液中的Rac1-GDP與GDIs結合維持失活狀態(tài)，Rac1-GDP-GDIs經SRC作用磷酸化后解離為Rac1-GDP。GEFs的作用使Rac1從無活性的Rac1-GDP變?yōu)橛谢钚缘腞ac1-GTP；GAPs的作用使Rac1從有活性的Rac1-GTP變?yōu)闊o活性的Rac1-GDP；GDIs的作用是維持Rac1-GDP狀態(tài)。人類基因組含有60多種GEFs、70多種GAPs和4種GDIs，通常情況下，Rac1主要處于與GDP結合的失活態(tài)，而鎖定這種狀態(tài)需要依靠GDIs，因此，Rac1的激活首先需要與GDIs解離，而這個過程需在Rac1-GDIs解離因子的作用下，通過SRC(sarcoma)家族酪氨酸蛋白激酶使Rac1-GDIs復合物磷酸化，從而使Rac1解離為Rac1-GDP，然后在GEFs的作用下，從無活性的Rac1-GDP變?yōu)橛谢钚缘腞ac1-GTP[16]。需要強調的是，GEFs的作用使GDP從Rac1-GDP上水解下來，并不會增加Rac1與GTP的結合力。事實上，Rac1與GTP和GDP的結合力相當，只是GTP的濃度遠高于GDP，Rac1正常的內源性GTP/GDP轉換活性是維持其正常生理作用的關鍵因素[17]。

GEFs：鳥嘌呤核苷酸交換因子；GAPs：GTP酶啟動蛋白；GDIs：鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子；Rac1：Ras相關C3肉毒毒素亞基1

激活態(tài)Rac1-GTP通過直接或間接作用啟動下游效應分子，從而啟動信號通路，主要與5種下游效應分子結合產生調節(jié)作用(圖3)：肌動蛋白細胞骨架和細胞極性的直接調節(jié)因子；混合蛋白，如信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activatar of transcription 3，STAT3)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)；p21活化蛋白激酶(p21-activated kinases，PAK)；酪氨酸激酶；磷脂激酶，如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)[16,18]。實驗發(fā)現，細胞黏附的調節(jié)與細胞極性的建立和保持密切相關[19]。與野生型細胞相比，Rac1剔除的細胞細胞間黏附作用增強，同時對基質的侵襲減弱[20]。Rac1信號異?？赡軙茐募毎o密連接的功能，從而增加細胞增殖，進而促進腫瘤的發(fā)生和生長[21]。肌動蛋白骨架具有促進細胞突起和收縮的功能，是細胞遷移的主要驅動力。Rac1可誘導肌動蛋白細胞骨架重組，使成纖維細胞形成板狀偽足和膜褶；同時Rac1也是細胞進入有絲分裂的調節(jié)因子，是細胞周期G2晚期中心體中PAK募集和啟動的先決條件[22]，但PAK并非由Rac1直接啟動，可能是被PAK自磷酸化或PAK上游激酶(如3-磷酸肌醇依賴性激酶1)啟動。此外，Rac1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶復合物的組成部分，是體內ROS產生的先決條件[23]。

Rac1：Ras相關C3肉毒毒素亞基1；STAT3：信號轉導及轉錄激活因子3；NF-κB：核因子κB；PAK：p21活化蛋白激酶；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶

2 Rac1異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系

隨著對Rac1研究的不斷深入，發(fā)現多種腫瘤的發(fā)生、存活、轉移、抗凋亡、耐藥性等腫瘤特性直接或間接與Rac1異常有關。例如，在非小細胞肺癌中，Rac1可通過啟動NF-κB調節(jié)細胞遷移和增殖[24]。

2.1Rac1活性異常與腫瘤的關系 Rac1活性異常增高主要與Rac1分子本身結構突變或被上游分子異常啟動有關；而Rac1活性降低與內源性和外源性因素有關，內源性因素主要是通過間接作用降低Rac1活性，而外源性因素主要作用于GEFs影響Rac1啟動，從而影響腫瘤的生物學特性。

2.1.1Rac1基因突變促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展 隨著人類基因組計劃的完成和實驗方法的更新，過去幾十年間確認了多種癌基因，而且部分腫瘤與Rac1基因突變存在一定的聯系。有研究表明，9.2%的太陽暴露黑色素瘤與Rac1突變體Rac1-P29S有關，Rac1-P29S高度保守開關1區(qū)的29位脯氨酸被絲氨酸取代[11,25]。Revach等[26]的研究發(fā)現，Rac1-P29S的活性顯著高于野生型，純合子Rac1-P29S的活性高于雜合子Rac1-P29S；此外，突變體Rac1-P29S和野生型Rac1對黑色素瘤侵襲性偽足功能的影響是通過不同的信號途徑實現的，說明Rac1點突變后，不僅活性增加了，其信號通路也發(fā)生了改變。Krauthammer等[25]發(fā)現，Rac1-P29S是黑色素瘤中繼BRAF(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)和NRAS(neuroblastoma RAS viral[V-ras] oncogene homolog)兩個癌基因后，第三個最常見的突變體。Rac1-P29S除了與太陽暴露的黑色素瘤有關，也與其他腫瘤密切相關。Kawazu等[27]研究發(fā)現，乳腺癌細胞株MDA-MB-157中也存在Rac1-P29S。除了突變體Rac1-P29S外，越來越多的突變體被發(fā)現與腫瘤有關。Kawazu等[27]在纖維肉瘤細胞株HT1080中發(fā)現了另一個Rac1突變體Rac1-N92I，Rac1-N92I是Rac1基因P環(huán)靠近 D11的第516位腺嘌呤(A)轉位成了胸腺嘧啶(T)，導致編碼蛋白92位的天冬氨酸被異亮氨酸取代；Rac1還有其他兩個突變體，即Rac1-C157Y和Rac1-P179L，其中Rac1-C157Y主要存在于肺腺癌，Rac1-P179L主要存在于皮膚鱗狀細胞[27]。所有Rac1突變體均有一個共同特性，即本構活性，其實質上是快周期突變體，即Rac1突變體能快速從失活態(tài)(與GDP結合)轉變?yōu)榧せ顟B(tài)(與GTP結合)[11,25]。體外實驗發(fā)現，所有這些突變體均能與非水解GTP類似物(GTPγS)快速結合癌，導致這種現象發(fā)生的原因不是因為這些突變體喪失了內在的GTP酶活性，而是因為GDP的解離加快；其中，突變體Rac1-C157Y比較特殊，它與GDT和GTP的解離均加快，因此其轉化特性比其他突變體要溫和一些[27]。綜上所述，Rac1突變后其突變體處于持續(xù)高活性狀態(tài)，且Rac1與細胞分化、黏附等特性有關，同時啟動了其他信號通路，因此導致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

2.1.2Rac1被異常調節(jié)與腫瘤的關系 除了基因突變，Rac1活性異常的另一個重要原因是受到上游調節(jié)因子的異常調節(jié)。前文已述，Rac1活性受GEFs、GAPs和GDIs的調控，其中GEFs是Rac1啟動的關鍵分子，因此Rac1的啟動主要受GEFs調節(jié)。幾乎所有的GEFs均具有一個脂質相互作用結構域Pleckstrin同源域(PH)、DOCK同源域1(DHR-1)或Bin-Amphiphysin-Rvs域(BAR)[28-29]。由于PH和DHR-1對磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和磷脂酰肌醇3,5-三磷酸等不同脂質的結合特異性和親和力不同[29-30]，因此GEFs可能會定向于特定的質膜結構域。相反，Rac1局部啟動后會在質膜上從GEFs優(yōu)勢區(qū)向GDIs優(yōu)勢區(qū)緩慢擴散[31]，這種現象可能是為了保持Rac1-GTP與Rac1-GDP之間的平衡。

T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子(T lymphoma invasion and metastasis induction factor，TIAM)是Rac1最常見的GEFs。研究發(fā)現，TIAM高表達會促進肺腫瘤細胞侵襲和轉移[32]；另外，三陰性乳腺癌細胞轉移和藥物抵抗也與TIAM引起的Rac1活性上調有關，原因是種族間高度同源保守的TUFT1(tuftelin 1)與p85α(Rab5的GAPs)結合啟動Rab5，Rab5募集TIAM上調Rac1活性，通過啟動NF-κB通路和抑制凋亡蛋白活性促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。NSC23766是第一個特異性Rac1抑制劑，Rac1抑制劑通過與GEFs上的特異性結構域結合使GEFs失活，從而使Rac1不能被激活(圖4)，體外實驗證實，NSC23766特異性抑制TIAM和Trio介導的細胞生長和轉化，但并不影響Vav介導的信號通路，同時也不影響其他Rho GTP酶(如RhoA、Cdc42)的啟動[33]。實驗發(fā)現，NSC23766抑制Rac1活性后可抑制肺癌細胞遷移、侵襲以及肌動蛋白骨架的重新排列[34]，也可降低腫瘤細胞與內皮細胞之間的黏附。在其他腫瘤模型中，NSC23766可以抑制Rac1介導的致瘤作用[35]。另有實驗室研究也發(fā)現，NSC23766能夠抑制小鼠結腸癌細胞照射后的活力[36]。其他Rac1的GEFs異常也與腫瘤有關，如原癌基因Vav3也是一種GEFs，81%的人類乳腺腫瘤存在Vav3過表達[37]。Trio是一種與細胞運動有關的GEFs，主要存在于預后差的乳腺癌中[38]。另有研究發(fā)現，抑制Rac1活性可以降低乳腺癌的侵襲性[4]。P-Rex1(PIP3-dependent Rac exchanger 1)是第一個被鑒定的P-Rex家族成員，最初從中性粒細胞中純化而來，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶形成ROS的過程中起著重要作用，它也是一種GEFs，主要存在于乳腺和前列腺腫瘤中[39-41]。Wertheimer等[42]報道，生長因子heregulin β1可持續(xù)增強Rac1在乳腺癌細胞中的活性，但未證明heregulin β1是否是一種GEFs。以上結果說明，通過GEFs增高Rac1活性會促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但抑制GEFs降低Rac1活性可以抑制或降低腫瘤細胞的惡性行為，產生抑癌效應。

Rac1：Ras相關C3肉毒毒素亞基1；GEFs：鳥嘌呤核苷酸交換因子

其他原因導致的Rac1活性增強也與部分腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關。在人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)陽性的宮頸癌中，HPV病毒編碼的E6蛋白通過Rac1/NF-κB/白細胞介素-6信號通路啟動STAT3活性，促進宮頸癌細胞增殖和存活[7]。在低氧環(huán)境下，NEDD9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 9)基因通過上調Rac1活性促進胃癌細胞轉移[43]。然而，Rac1活性降低可下調去泛素化酶Usp9X，使骨髓細胞白血病蛋白1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)的穩(wěn)定性降低，抑制Rac1活性的同時聯合抑制Bcl-2/Bcl-xL可在多種膠質母細胞瘤細胞中產生協同促凋亡和抗轉移作用，使雞胚絨毛膜上膠質母細胞瘤的成瘤能力顯著減弱[44]。鼻咽癌一直是臨床比較棘手的問題，新的抑癌基因白細胞黏附樣分子CHL1(close homologue of L1)可顯著抑制鼻咽癌腫瘤細胞的生長和轉移，其機制之一是通過PI3K/蛋白激酶B通路抑制Rac1/Cdc42信號通路活性，影響板狀偽足和絲狀偽足的形成[45]。二烯丙基二硫也可通過PI3K/蛋白激酶B抑制Rac1介導的PAK1-LIMK1(lim kinase 1)-Cofilins通路，阻斷結腸癌細胞上皮-間充質轉化、侵襲和轉移[46]。此外，阻斷PI3K與Rac1之間的作用，可使表皮生長因子突變體驅動的肺癌消退[47]。表皮分化調節(jié)因子ΔNp63α上調微RNA(micro RNA，miRNA/miR)-320a，miR-320a下調蛋白激酶Cγ亞型，導致Rac1磷酸化抑制，結果抑制了癌細胞的侵襲性[48]。

綜上所述，無論通過GEFs還是其他因素，在眾多腫瘤中均可看到Rac1活性增強，當Rac1特異性抑制劑NSC23766、化合物二烯丙基二硫或者一些調節(jié)因子抑制Rac1活性后，腫瘤也均被抑制，說明Rac1活性過度增強會促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

2.2Rac1表達異常與腫瘤的關系 除了Rac1活性異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關外，Rac1表達異常也與腫瘤有關。例如，部分非小細胞肺癌患者早期手術預后不良與Rac1表達增高呈相關性[49]，這可能與非小細胞肺癌腫瘤干細胞中Rac1的高表達會增強腫瘤細胞的惡性行為有關[10]。這種情況在其他腫瘤中也同樣存在，如在血液病中，Rac1表達上調可以促進成纖維細胞生長因子受體1驅動的干細胞白血病/淋巴瘤綜合征白血病的發(fā)生[50]，且與患者的淋巴結轉移、TNM分期及分化不良有關[51]。在結直腸癌細胞株(Lovo、SW480、SW620、SW1116和HT29)中Rac1也過表達，而Rac1缺失則可抑制癌細胞的遷移和侵襲[52]。另外，在其他實驗中也觀察到抑制Rac1表達可以抑制腫瘤細胞增殖或侵襲。例如，Peng等[53]通過miR-142-3p降低Rac1水平，結果發(fā)現，可抑制葡萄膜黑色素瘤的增殖、轉移和侵襲。另外，通過基因剔除技術剔除Rac1基因發(fā)現，雖然增加了細胞的機械變形能力，但同時也降低了細胞侵襲基質的能力[20]。臨床上，某些抗腫瘤藥的作用機制也是通過抑制Rac1表達達到抗癌效果的，如雷公藤甲素，其作用機制之一便是誘導產生miR-146a，miR-146a作用于RhoA和Rac1信使RNA使其表達降低，從而抑制乳腺癌細胞轉移[54]。綜上所述，不管是在實體腫瘤還是在血液病中，Rac1表達增高不僅與腫瘤惡性行為增加有關，還與患者預后具有相關性。在實驗室或臨床中，通過降低Rac1水平能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲等惡性行為，從而達到抗腫瘤的目的，說明Rac1表達過高與很多腫瘤的惡性程度及預后密切相關。

3 小 結

Rac1在細胞生理活動中發(fā)揮著重要作用，且越來越多的腫瘤與Rac1異常有關。致瘤因素通過直接或間接途徑上調Rac1活性或表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而下調Rac1活性或表達則可減弱腫瘤的惡性行為。目前研究的重點是找到特異性Rac1抑制劑，達到抗腫瘤的目的。除了NSC23766外，還有多種Rac1特異性抑制劑可在不影響RhoA和Cdc42激活的前提下選擇性抑制Rac1的激活。而后期研究的重點主要包括：通過基因靶向修復或失活Rac1突變體，達到治療或抑制腫瘤的目的；研究Rac1與其他致癌因素間的協同作用，主要是信號通路相互交叉的部分；通過明確作用機制，積極研制更有效的抗癌藥物。