過表達(dá)Nrf2蛋白對妊娠糖尿病孕鼠胎盤氧化應(yīng)激及子鼠心臟功能的影響

趙曉蘭，王玉玨，岳軍，梅頡，李玲玲

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610027

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在抗氧化防御基因的轉(zhuǎn)錄激活及氧化還原穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)中起重要作用。Nrf2被阻抑分子Keap1保留為無活性的復(fù)合物[1]。然而，在應(yīng)對氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1分離進(jìn)入細(xì)胞核后與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游的細(xì)胞保護(hù)性分子的表達(dá)，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠中最常見的代謝紊亂，其定義為“妊娠中期及妊娠晚期發(fā)展為葡萄糖不耐癥的類型，導(dǎo)致嚴(yán)重程度不一的高血糖癥”[3-4]。Nrf2失調(diào)已被證實(shí)與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)[5-7]，然而其具體的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠GDM模型，探討過表達(dá)Nrf2蛋白對GDM孕鼠胎盤氧化應(yīng)激及子鼠心臟功能的影響，以期為揭示GDM可能的發(fā)病機(jī)制及對子代產(chǎn)生的影響提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 36只6周齡封閉群清潔級未經(jīng)產(chǎn)C57小鼠，體重(24.65±0.56) g，購自四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、N鈣黏蛋白(N-cadherin)、生存素(Survivin)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體購自美國Sigma公司。二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；MatrigelTM底膜基質(zhì)(美國BD公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；OLYMPUS DP71顯微鏡(日本Olympus光學(xué)有限公司)；高速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)；GDS-800 UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)；小鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB form，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌紅蛋白(myoglobin，MB)ELISA試劑盒(中國武漢博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與分組 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，夜晚按照雌雄2:1比例合籠交配，次日清晨有陰栓者或陰道分泌物涂片見精子者視為交配成功，計(jì)為妊娠第0天。將36只妊娠成功的小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、模型組、pcDNA組及Nrf2組，每組9只。后3組小鼠禁食12 h后給予新鮮STZ溶液30 mg/kg、間隔24 h腹腔注射，共注射3次；對照組僅注射等體積生理鹽水。第一次注射STZ后24 h，Nrf2組腹腔注射轉(zhuǎn)染Nrf2過表達(dá)腺病毒；pcDNA組腹腔注射轉(zhuǎn)染空載包裝的腺病毒；其余兩組注射等體積生理鹽水。注射后72 h即為妊娠第4天，于空腹孕鼠眼球后靜脈采血，離心分離血清后用葡萄糖測定試劑盒檢測血糖水平，若≥16.7 mmol/L為造模成功。

1.2.2 各組空腹血糖、子宮指數(shù)、總胎數(shù)和流產(chǎn)數(shù)的測定 各組孕鼠空腹12 h后于眼球后靜脈叢采血，血液靜置于1.5 ml離心管中，2 h后離心，取上層血清10 μl用葡萄糖測定試劑盒檢測血糖水平。將懷孕9 d的小鼠斷頸處死后剖腹取出子宮，稱重并計(jì)數(shù)胚胎數(shù)，計(jì)算子宮指數(shù)和流產(chǎn)數(shù)。子宮指數(shù)=子宮重量/體重×100%；流產(chǎn)數(shù)=著床點(diǎn)數(shù)－活胎點(diǎn)數(shù)。

1.2.3 檢測SOD活性及MDA、GSH的含量 獲取各組孕鼠胎盤組織，分別采用相應(yīng)試劑盒以羥胺法、TBA法及比色法定SOD活性及MDA、GSH的含量。具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 HE染色觀察孕鼠肝腎及子鼠心臟組織形態(tài)學(xué)變化 分別取每組3只孕鼠肝臟、腎臟組織及子鼠心臟組織放入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片，然后行HE染色：將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ及100%、95%、90%、80%、70%的乙醇各10 min，用自來水沖洗；分別行蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

1.2.5 超聲測量子鼠心臟功能指標(biāo) 檢測各組子鼠心率(heart rate，HR)，記錄心電圖T波變化，并通過BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄子鼠的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.2.6 ELISA法檢測子鼠血清中CK-MB、MB、cTnI含量 取各組子鼠外周血，分離出血清。采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定子鼠血清CKMB、MB、cTnI的含量。

1.2.7 RT-PCR檢測Nrf2 mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取孕鼠胎盤總RNA，并通過超微紫外分光光度計(jì)測定260 nm及280 nm波長處的吸光度。按照試劑盒說明書使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit進(jìn)行PCR，分別在95 ℃ 15 s及60 ℃ 60 s條件下使用ABI 7500將反應(yīng)激活。引物如下：Nrf2正向5'-CTGAACTCCTGGACGGGACTA-3'，反向5'-CGGTGGGTCTCCGTAAATGG-3'；GAPDH正向5'-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3'，反向5'-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3'。

1.2.8 Western blotting檢測Nrf2蛋白表達(dá)水平取適量孕鼠胎盤組織或子鼠心臟組織，勻漿后按1:3比例加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清，根據(jù)BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度。將勻漿上清液與上樣緩沖液按1:1配比，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發(fā)光劑顯影，采用Bio-Rad GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J2x軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行測量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組GDM孕鼠胎盤組織Nrf2表達(dá)水平比較與對照組(1.000±0.000)比較，模型組及pcDNA組Nrf2 mRNA水平(分別為0.11±0.04、0.12±0.07)均明顯降低(P<0.05)，而Nrf2組與對照組比較無明顯差異；與模型組比較，Nrf2組的Nrf2 mRNA水平(2.34±0.54)明顯升高(P<0.05)，而pcDNA組與模型組比較無明顯差異。與對照組(0.070±0.015)比較，模型組及pcDNA組Nrf2蛋白表達(dá)水平(分別為0.010±0.005、0.013±0.006)均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，Nrf2組的Nrf2蛋白表達(dá)水平(0.260±0.040)明顯升高(P<0.05)，而pcDNA組與模型組比較無明顯差異(圖1)。

圖1 各組Nrf2蛋白表達(dá)水平(Western blotting)Fig.1 Nrf2 expression in each groups (Western blotting)

2.2 各組孕鼠空腹血糖、子宮指數(shù)、總胎數(shù)及流產(chǎn)率比較 與對照組比較，模型組孕鼠的空腹血糖及流產(chǎn)率明顯升高，子宮指數(shù)及總胎數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA組比較，Nrf2組孕鼠的空腹血糖及流產(chǎn)率明顯降低，子宮指數(shù)及總胎數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 各組孕鼠胎盤組織SOD活性及MDA、GSH含量比較 與對照組比較，模型組的MDA含量明顯升高，SOD活性和GSH含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA組比較，Nrf2組的MDA含量明顯降低，SOD活性和GSH含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 各組孕鼠空腹血糖、子宮指數(shù)、總胎數(shù)及流產(chǎn)率的比較(±s，n=9)Tab.1 Fasting blood glucose, uterine index, total number of fetuses and abortion rate of pregnant mice in each groups (±s, n=9)

表1 各組孕鼠空腹血糖、子宮指數(shù)、總胎數(shù)及流產(chǎn)率的比較(±s，n=9)Tab.1 Fasting blood glucose, uterine index, total number of fetuses and abortion rate of pregnant mice in each groups (±s, n=9)

與對照組比較，(1)P<0.05；與pcDNA組比較，(2)P<0.05。

組別 空腹血糖(mmol/L) 子宮指數(shù) 總胎數(shù) 流產(chǎn)率(%)對照組 4.15±0.66 0.015±0.003 15.46±3.07 7.34±5.98模型組 12.72±2.94(1) 0.009±0.003(1) 9.23±2.12(1) 75.24±8.95(1)pcDNA組 12.58±2.46 0.008±0.002 9.42±2.48 74.29±9.23 Nrf2組 5.13±0.74(2) 0.013±0.001(2) 12.55±3.17(2) 16.28±6.97(2)F 49.48 17.09 10.42 192.51 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01

表2 各組SOD活性及MDA、GSH含量比較(±s，n=9)Tab.2 Comparison of SOD activity, MDA and GSH content among each groups (±s, n=9)

表2 各組SOD活性及MDA、GSH含量比較(±s，n=9)Tab.2 Comparison of SOD activity, MDA and GSH content among each groups (±s, n=9)

與對照組比較，(1)P<0.05；與pcDNA組比較，(2)P<0.05。

組別 SOD(U/ml) MDA(mmol/ml) GSH(U/mg prot)對照組 6.13±1.00 2.17±0.51 6.39±1.04模型組 2.48±0.87(1) 5.45±0.62(1) 1.01±0.32(1)pcDNA組 2.54±0.66 5.28±0.46 1.42±0.48 Nrf2組 4.96±0.84(2) 3.22±0.65(2) 4.37±0.58(2)F 40.98 72.22 133.50 P<0.01 <0.01 <0.01

2.4 各組孕鼠肝臟及腎臟組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 對照組小鼠肝細(xì)胞索排列整齊、規(guī)則，細(xì)胞無變性；腎臟組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊。模型組及pcDNA組肝細(xì)胞索排列紊亂，灶性壞死、脂肪變性及炎細(xì)胞浸潤明顯；腎臟基底膜增生，糖原沉積，可見間質(zhì)區(qū)域的炎性細(xì)胞浸潤及纖維化。Nrf2組肝細(xì)胞壞死得以改善，浸潤性炎性細(xì)胞數(shù)量減少，腎損傷情況得以改善，糖原沉積減輕，間質(zhì)區(qū)域的炎性細(xì)胞浸潤及纖維化程度減輕(圖2)。

2.5 各組子鼠心臟組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平比較與對照組(0.050±0.017)比較，模型組Nrf2蛋白表達(dá)水平(0.007±0.005)明顯降低(P<0.05)。與pcDNA組(0.008±0.004)比較，Nrf2組Nrf2蛋白表達(dá)水平(0.220±0.030)明顯升高(P<0.05，圖3)。

圖2 各組孕鼠肝臟及腎臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE ×400)Fig.2 Morphological changes of liver and kidney tissues of pregnant mice in each group (HE staining, ×400)

圖3 各組子鼠心臟組織中Nrf2蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression of Nrf2 protein in heart tissues of offspring mice in each group

2.6 各組子鼠心臟功能指標(biāo)比較 與對照組比較，模型組子鼠的HR、LVSP、LVEF、FS均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA組比較，Nrf2組子鼠的HR、LVSP、LVEF、FS均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.7 各組子鼠血清CK-MB、MB、cTnI含量比較 與對照組比較，模型組子鼠血清CK-MB、MB及cTnI含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA組比較，Nrf2組子鼠血清CKMB、MB、cTnI含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

2.8 各組子鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 對照組子鼠心肌細(xì)胞邊緣清晰，核膜完整，心肌纖維排列整齊，無細(xì)胞間質(zhì)水腫；模型組及pcDNA組子鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，明顯的細(xì)胞間質(zhì)水腫，界限模糊，有少量交叉條紋；Nrf2組子鼠心肌細(xì)胞間水腫減輕，心肌損傷介于模型組與對照組之間(圖4)。

表3 各組子鼠心臟功能指標(biāo)比較(±s，n=9)Tab.3 Comparison of cardiac function indicators of offspring mice among each group (±s, n=9)

表3 各組子鼠心臟功能指標(biāo)比較(±s，n=9)Tab.3 Comparison of cardiac function indicators of offspring mice among each group (±s, n=9)

與對照組比較，(1)P<0.05；與pcDNA組比較，(2)P<0.05。

組別 HR(次/min) LVSP(mmHg) LVEF(%) FS(%)對照組 432.86±56.03 138.24±35.09 57.05±6.59 27.12±4.43模型組 208.77±26.52(1) 55.02±14.15(1) 21.56±8.45(1) 7.05±1.89(1)pcDNA組 210.62±28.61 57.13±10.76 20.38±7.06 7.39±1.43 Nrf2組 328.17±64.33(2) 102.87±24.42(2) 43.26±6.42(2) 21.25±3.13(2)F 47.27 26.79 55.23 104.51 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01

表4 各組子鼠血清CK-MB、MB、cTnI含量比較(±s，n=9)Tab.4 Comparison of CK-MB, MB and cTnI contents in offspring mice among each group (±s, n=9)

表4 各組子鼠血清CK-MB、MB、cTnI含量比較(±s，n=9)Tab.4 Comparison of CK-MB, MB and cTnI contents in offspring mice among each group (±s, n=9)

與對照組比較，(1)P<0.05；與pcDNA組比較，(2)P<0.05。

組別 CK-MB (U/L) MB (ng/ml) cTnI (ng/ml)對照組 25.97±4.38 29.08±8.09 0.11±0.01模型組 123.55±19.26(1) 149.17±24.33(1) 0.67±0.03(1)pcDNA組 119.74±18.07 147.38±21.54 0.65±0.02 Nrf2組 58.02±7.53(2) 64.23±10.42(2) 0.27±0.05(2)F 106.5 106.8 719.7 P<0.01 <0.01 <0.01

3 討 論

GDM與流產(chǎn)、胎膜早破及其他妊娠異常相關(guān)[8]。GDM的病因復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制和流行病學(xué)特征涉及多個(gè)遺傳及環(huán)境因素。GDM給母體、發(fā)育中的胎兒及后代均帶來了嚴(yán)重的短期及長期健康風(fēng)險(xiǎn)，包括隨后發(fā)生于母體的2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，以及后代出現(xiàn)不良心臟代謝表型的風(fēng)險(xiǎn)等[9]。本研究結(jié)果顯示，Nrf2過表達(dá)可引起孕鼠空腹血糖及流產(chǎn)率降低，子宮指數(shù)及總胎數(shù)增加，提示Nrf2過表達(dá)可降低孕鼠流產(chǎn)率。

圖4 各組子鼠心臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE ×400)Fig.4 Morphological changes of heart tissue in each group of offspring mice (HE ×400)

氧化應(yīng)激在GDM的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[10]?；加蠫DM的孕婦表現(xiàn)出高血糖引起的循環(huán)氧化應(yīng)激增加及抗氧化酶減少[11-12]。MDA是由病理性疾病(如糖尿病)中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的磷脂降解產(chǎn)生的，通常用于指示脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激[13-14]。SOD及GSH是人體中普遍存在的抗氧化劑，可保持氧化還原反應(yīng)的平衡。GDM患者血液中的SOD及GSH水平明顯降低，MDA水平明顯升高，氧化應(yīng)激增加[8,15]。本研究結(jié)果顯示，Nrf2過表達(dá)使SOD活性及GSH含量升高，MDA含量降低，GDM孕鼠肝腎組織的病理損傷減輕，提示Nrf2過表達(dá)可緩解GDM孕鼠的氧化應(yīng)激。

Nrf2的失調(diào)已被證實(shí)與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病孕婦胎盤中的Nrf2表達(dá)降低，從而降低了血紅素氧化酶1的表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，子鼠心臟組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平升高，提示Nrf2過表達(dá)可能對子鼠心臟具有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2表達(dá)升高對糖尿病心肌病[17]及糖尿病腎病[18]有保護(hù)作用，這與本研究結(jié)果一致。還有研究證實(shí)，在動(dòng)脈粥樣硬化、局部缺血、再灌注、心臟肥大、心力衰竭及糖尿病等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Nrf2的過表達(dá)對心臟功能具有保護(hù)作用[19]。3種心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、MB及cTnI在心肌損傷診斷中發(fā)揮著重要作用[20]。cTnI對心肌損傷診斷具有很高的敏感度及特異度。研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重心肌損傷小鼠血漿中cTnI的表達(dá)水平明顯升高[21]。本研究結(jié)果顯示，Nrf2過表達(dá)可使子鼠的HR、LVSP、LVEF、FS明顯升高，血清中的CK-MB、MB、cTnI含量明顯降低，并減輕了心肌損傷，這些都進(jìn)一步證實(shí)了Nrf2過表達(dá)對子鼠心臟功能的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Nrf2過表達(dá)降低了孕鼠的空腹血糖、流產(chǎn)率、MDA含量，以及子鼠血清CK-MB、MB、cTnI含量，提高了子宮指數(shù)、總胎數(shù)、SOD活性及GSH含量，以及子鼠的HR、LVSP、LVEF、FS，減輕了孕鼠肝腎組織的病理損傷和子鼠的心肌損傷，提示過表達(dá)Nrf2蛋白能夠減緩GDM孕鼠胎盤的氧化應(yīng)激并維持子鼠心臟功能，為揭示GDM可能的發(fā)病機(jī)制及對子代產(chǎn)生的影響提供了理論依據(jù)。