我國(guó)動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀分析與建議*

王梓樂 高志強(qiáng) 汪 琳** 江海洋**

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 101113)

動(dòng)物寄生蟲病多指由寄生于動(dòng)物的致病性寄生蟲引起的疾病。目前，多數(shù)寄生蟲病為慢性消耗性疾病，臨床表現(xiàn)為感染動(dòng)物逐漸消瘦，但病死率較低，因而社會(huì)各界對(duì)于動(dòng)物寄生蟲病的關(guān)注度較低。近年來隨著人們生活水平的提高及對(duì)畜產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和口感要求的提高，食生、半生肉及水產(chǎn)品的現(xiàn)象屢見不鮮(俞強(qiáng)，2015)，在此背景下生肉與水產(chǎn)品中的寄生蟲對(duì)人體健康造成了嚴(yán)重威脅。據(jù)報(bào)道，全世界每年有超過一半以上的人口受到寄生蟲病的威脅,每年有數(shù)百萬的人死于寄生蟲病(俞強(qiáng)，2015)，我國(guó)衛(wèi)生部一項(xiàng)調(diào)查顯示，動(dòng)物源性寄生蟲病已成為新“富貴病”，城鎮(zhèn)居民特別是沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的感染人數(shù)呈逐年上升勢(shì)頭(張衛(wèi)兵等，2012)。

對(duì)動(dòng)物(陸生和水生)進(jìn)行寄生蟲檢測(cè)，是防控食源性寄生蟲病的關(guān)鍵(楊俊，2017)。我國(guó)雖然已就動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)制定了一系列相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，如《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性水產(chǎn)制品》GB 10136—2015中明確要求即食生制動(dòng)物性水產(chǎn)制品不得檢出吸蟲囊蚴、線蟲幼體及絳蟲裂頭蚴，但目前我國(guó)現(xiàn)有的寄生蟲檢測(cè)資源以及檢測(cè)依據(jù)——檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量和質(zhì)量并不能滿足食品安全的現(xiàn)實(shí)需求。本文系統(tǒng)整理了現(xiàn)有寄生蟲檢測(cè)方法及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)情況，對(duì)各種檢測(cè)方法進(jìn)行分析比較，以期為我國(guó)未來寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)和制修訂提供相關(guān)依據(jù)。

1 寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)總體情況

目前，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)體系中，涉及寄生蟲檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)共有103個(gè)，其中國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)13個(gè)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)27個(gè)(表1)、檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)31個(gè)(表2)、水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)30個(gè)(表3)、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)7(表4)、衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)8個(gè)(表5)。

表1 寄生蟲檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

表2 寄生蟲檢測(cè)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

表3 寄生蟲檢測(cè)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

表4 寄生蟲檢測(cè)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

表5 寄生蟲檢測(cè)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

動(dòng)物寄生蟲國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)見OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)-第七版,規(guī)范了棘球蚴/包蟲、利什曼原蟲、旋毛蟲、伊氏錐蟲、蜂孢子蟲、牛巴貝斯蟲、泰勒蟲、毛滴蟲、錐蟲、馬梨形蟲、隱孢子蟲、囊蟲、弓形蟲等的采樣和檢測(cè)方法。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有6項(xiàng)規(guī)范人感染寄生蟲診斷和消除，包括血吸蟲病、絲蟲病、剛地弓形蟲的診斷，方法主要是臨床癥狀診斷和血清免疫檢查，由于國(guó)內(nèi)公共安全控制有效，人民生活水平提高，寄生蟲感染病例少，免疫學(xué)診斷方法基本能滿足診斷需求；有12項(xiàng)規(guī)范實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中寄生蟲檢測(cè)，包括寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、體外寄生蟲檢測(cè)方法，體內(nèi)弓形蟲、兔腦原蟲、卡氏肺孢子蟲、艾美耳球蟲、蠕蟲、瘧原蟲、犬惡絲蟲、腸道溶組織內(nèi)阿米巴、腸道鞭毛蟲和纖毛蟲的檢測(cè)方法，主要是免疫檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布時(shí)間早，主要集中在2001年，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境控制好、染病動(dòng)物少，有標(biāo)準(zhǔn)可依就能滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理需求，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)基本沒有更新；有7項(xiàng)規(guī)范家畜感染寄生蟲診斷，包括血吸蟲、旋毛蟲、囊尾蚴、伊氏錐蟲病、球蟲病等的診斷技術(shù)，由于家畜感染寄生蟲病例多情況復(fù)雜，所以家畜寄生蟲檢測(cè)的方法發(fā)展最快，除了血清學(xué)免疫檢測(cè)，近年不斷發(fā)展出分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如旋毛蟲實(shí)時(shí)熒光PCR、隱孢子蟲套式PCR等，目前家畜寄生蟲檢測(cè)的國(guó)標(biāo)還不能完全滿足臨床診斷需求，又發(fā)展了很多行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)作為補(bǔ)充；有2項(xiàng)是規(guī)范水生動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)，包括腦粘體蟲和派琴蟲的檢測(cè)。水生動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)很少，由于以前主要是水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)需要檢測(cè)水生動(dòng)物寄生蟲，其他行業(yè)需求較少，水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)基本就能滿足需求；近年由于食品安全關(guān)注到水產(chǎn)品中寄生蟲檢測(cè)，市場(chǎng)監(jiān)管部門也需要對(duì)水生動(dòng)物寄生蟲開展檢測(cè)，故水生動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)需要更多的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)做支撐。

檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了部分種類活動(dòng)物、動(dòng)物源性食品和水產(chǎn)品中寄生蟲的檢測(cè)，包括微孢子蟲、弓形蟲、旋毛蟲、錐蟲、焦蟲、住白細(xì)胞蟲、囊尾蚴、隱孢子蟲、吸蟲等，基本是根據(jù)我國(guó)與不同國(guó)家簽到的議定書規(guī)定制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，所以涉及的寄生蟲種類多，方法種類也多，有顯微鏡檢、間接血凝、酶聯(lián)免疫吸附、補(bǔ)體結(jié)合、PCR法等，標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新。由于機(jī)構(gòu)整合，2018年4月檢驗(yàn)檢疫轉(zhuǎn)隸到海關(guān)，以后不會(huì)再有新的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。

水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了牡蠣和魚類寄生蟲的檢測(cè)，包括單孢子蟲、小胞蟲、拍琴蟲、馬爾太蟲、納米蟲、異尖線蟲等，由于寄生蟲對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)影響很多，故寄生蟲病的診斷得到高度重視，發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)也多，方法有細(xì)胞學(xué)診斷、病理學(xué)診斷、原位雜交診斷、透射電鏡診斷等，同一種寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)更新少，基本是新出現(xiàn)一種寄生蟲就發(fā)布一批不同方法、或者不同亞種、或者針對(duì)不同宿主的標(biāo)準(zhǔn)。

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了活動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)，包括棘球蚴、弓形蟲、線蟲、滴蟲、隱孢子蟲等，農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量不多，但基本都是綜合的診斷技術(shù)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)包括了多種亞種和多種檢測(cè)方法，既能滿足實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)需求，也能指導(dǎo)臨床診斷。

衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了人感染寄生蟲病的診斷，包括絲蟲病、阿米巴蟲、包蟲病、吸蟲病、絳蟲病的診斷，早期發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)多是臨床癥狀診斷和免疫檢測(cè)方法，新發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)也開始利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

2 我國(guó)動(dòng)物寄生蟲病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)前處理、采樣及檢測(cè)方法

選取我國(guó)動(dòng)物寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其適用范圍，樣品采集與前處理以及檢測(cè)方法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)匯總(由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物類寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)自成體系，因此未匯總在內(nèi))，見表6。

表6 我國(guó)動(dòng)物寄生蟲病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡(jiǎn)介

2.1 采樣和前處理

對(duì)于不同的寄生蟲病，不同的感染動(dòng)物和不同的檢測(cè)方法，采樣種類和前處理過程也有所不同。我國(guó)現(xiàn)有寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)對(duì)采樣和前處理方法均進(jìn)行了詳細(xì)描述，使得現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)可操作性較強(qiáng)。

2.2 蟲體檢測(cè)方法

我國(guó)現(xiàn)有寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)主要為傳統(tǒng)肉眼或鏡檢檢測(cè)方法,這主要是由于寄生蟲個(gè)體相對(duì)較大，肉眼或鏡下有相對(duì)典型的形態(tài)特征，多數(shù)情況下可根據(jù)其形態(tài)特征即可作出診斷，這也是形態(tài)學(xué)檢查方法廣為使用的原因。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)方法

就寄生蟲病而言，由于蟲體的抗原構(gòu)成相對(duì)復(fù)雜，敏感而特異的血清學(xué)方法目前并不多見，采用血清學(xué)檢測(cè)的寄生蟲病多見于陸生動(dòng)物血液寄生蟲病。這也是寄生蟲病血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為數(shù)不多的原因。目前寄生蟲病血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)所用方法主要有間接血凝試驗(yàn)(血吸蟲病、弓形蟲病、棘球蚴病)，乳膠凝集試驗(yàn)(伊氏錐蟲病)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(牛錐蟲病，牛、羊、馬焦蟲病)以及ELISA(旋毛蟲病、伊氏錐蟲病、棘球蚴病、馬焦蟲病和囊蟲病)。

2.4 核酸檢測(cè)方法

盡管蟲體形態(tài)學(xué)檢查目前仍然是動(dòng)物寄生蟲病的主要手段和“金標(biāo)方法”，但在某些蟲體小，形態(tài)特征存在多樣性、蟲荷低以及早期或不顯性感染時(shí)，形態(tài)學(xué)檢查就凸顯其局限性。隨著核酸技術(shù)的發(fā)展，DNA探針技術(shù)、PCR和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)以及LAMP技術(shù)已經(jīng)開始用于一些寄生蟲病的檢測(cè)(肖樣，2000；魏永紅等，2011)。目前隨著對(duì)動(dòng)物寄生蟲基因組序列的深入研究，許多種特異性、株特異性靶位點(diǎn)得以發(fā)現(xiàn)，可以預(yù)期，基于PCR的技術(shù)將會(huì)在寄生蟲病原快速檢測(cè)上發(fā)揮越來越重要的作用(許靜等，2007)。但目前我國(guó)動(dòng)物寄生蟲病原核酸檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的制定明顯滯后，從表6可以看出，很多寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)缺乏核酸檢測(cè)方法，沒有跟上應(yīng)用的技術(shù)發(fā)展步伐。

3 結(jié)論與建議

3.1 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定缺乏系統(tǒng)性，建議開展寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系研究

目前動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)制定缺乏頂層設(shè)計(jì)，動(dòng)物寄生蟲病種類繁多、寄主復(fù)雜，有許多缺乏標(biāo)準(zhǔn)，而有的寄生蟲由多家單位獨(dú)立制定了多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，方法和適用性存在部分交叉，例如旋毛蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，有的只適用于豬，有的適用于多種動(dòng)物；寄生蟲的名稱也不夠統(tǒng)一，例如梨形蟲檢測(cè)，有的標(biāo)準(zhǔn)稱為梨形蟲病，有的稱為焦蟲病。建議制定標(biāo)準(zhǔn)體系表來統(tǒng)領(lǐng)各類檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，既便于指導(dǎo)新標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)，也便于用戶的檢索和使用。

3.2 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于形態(tài)學(xué)檢測(cè)，建議豐富標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法

目前現(xiàn)有寄生蟲檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)多為形態(tài)學(xué)鑒定。盡管形態(tài)學(xué)檢查不需要特殊設(shè)備，具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。但對(duì)檢測(cè)人員要求高，需要深厚的寄生蟲基礎(chǔ)知識(shí)儲(chǔ)備，檢測(cè)判定存在主觀性較強(qiáng)的缺點(diǎn)。在很多情況下(如蟲體形態(tài)小、蟲荷低、特征多樣性等)，形態(tài)學(xué)檢查存在明顯的局限性。標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于形態(tài)學(xué)檢測(cè)可能是造成國(guó)內(nèi)很少檢測(cè)機(jī)構(gòu)能開展寄生蟲檢測(cè)的原因之一。目前隨著動(dòng)物寄生蟲基因組序列的深入研究，許多種特異性、株特異性靶位點(diǎn)得以發(fā)現(xiàn)，許多基于核酸檢測(cè)的方法已經(jīng)開始逐步用于寄生蟲的檢測(cè)(Wongetal.，2014)。但目前動(dòng)物寄生蟲病原核酸檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的制定略微滯后，建議加大寄生蟲核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)。

3.3 實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品匱乏，建議開展標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制工作

由于很多寄生蟲采集困難，培養(yǎng)難度大，目前全國(guó)許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)都存在缺乏寄生蟲實(shí)物標(biāo)本，沒有參比對(duì)照，在出現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征不明顯的蟲體時(shí)，檢測(cè)人員無法比對(duì)鑒別；沒有實(shí)物做標(biāo)準(zhǔn)品，也不利于分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法的驗(yàn)證和推廣使用。為了提高全國(guó)寄生蟲檢測(cè)水平，急需開展寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)樣品研制工作。在構(gòu)建寄生蟲圖譜數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，制備多種標(biāo)準(zhǔn)樣品(包括形態(tài)學(xué)實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品和核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品)，用于方法和標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證以及試驗(yàn)時(shí)間比對(duì)，從而更好服務(wù)于寄生蟲檢測(cè)工作的推廣應(yīng)用。整體提升動(dòng)物寄生蟲病檢測(cè)水平，并應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)控檢測(cè)中，為保障肉制品及水產(chǎn)品的安全和人民健康提供有力的技術(shù)支撐。