新疆石河子地區(qū)某牧場(chǎng)致奶牛乳房炎大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

馬博，卜三平，劉鴿

（1.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，庫(kù)爾勒 841000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊 830000）

奶牛乳房炎與蹄病、酮病并稱為奶牛場(chǎng)三大常見疾病[1～5]，而乳房炎是危害奶牛場(chǎng)發(fā)展的三大疾病之首。奶牛乳房炎給奶牛場(chǎng)的生產(chǎn)工作帶來嚴(yán)重影響，并存在危害人們健康的危險(xiǎn)，防治奶牛乳房炎是一項(xiàng)非常重要的工作。引起奶牛乳房炎的原因是多方面的[6～12]，其中病原微生物感染是主要原因[13]，引發(fā)奶牛乳房炎的主要致病菌有兩類：一類是接觸傳染性致病菌，主要包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌、支原體、牛棒狀桿菌等[14]；一類是環(huán)境性病原菌，主要是一些革蘭氏陰性菌，如大腸埃希桿菌、腸道桿菌、停乳鏈球菌、糞腸球菌等[15]。引起奶牛乳房炎的致病菌有上百種，其中最常見的是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌[16]。本試驗(yàn)主要對(duì)從某規(guī)?；膛?chǎng)采集的乳樣進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定，目的是為后續(xù)治療試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

在新疆石河子地區(qū)的某規(guī)?；膛?chǎng)進(jìn)行了乳房炎流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分臨床型乳房炎奶牛和隱性乳房炎奶牛，選擇12頭臨床型乳房炎奶牛的20個(gè)患乳區(qū)乳樣和12頭隱性乳房炎奶牛的16個(gè)患乳區(qū)乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。

1.1.2 主要試劑

瓊脂糖、革蘭氏快速染色液、Taq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker（購(gòu)自TaKaRa有限公司，大連)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成）；強(qiáng)力霉素（DO）、青霉素（P）、林可霉素（CD）、阿洛西林（AZL）、桿菌肽（B）、紅霉素（E）、氟苯尼考（FFC）、優(yōu)立新（SAM）、頭孢曲松（CTRX）、新霉素（N）、先鋒霉素（KZ）、氨芐青霉素（AMP）、阿莫西林（AMC）、慶大霉素（CN）、鏈霉素（STR）、阿米卡星（AMK）、恩諾沙星（ENR）、氯霉素（C）、復(fù)方新諾明（SXT）、呋喃唑酮（F）共20種藥敏紙片。

麥康凱瓊脂（MAC，北京奧博生物）、胰蛋白胨（北京奧博生物）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA，實(shí)驗(yàn)室配置）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB，實(shí)驗(yàn)室配置）、酵母浸粉（上海藍(lán)季科技），LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、鄧亨氏水按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配置。大腸桿菌生化鑒定培養(yǎng)基（如蔗糖培養(yǎng)基）、三糖鐵、檸檬酸鹽、甘露醇、吲哚、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、M.R、V-P，均按照實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基的常用方法進(jìn)行配置[17]。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的富集、分離和純化

首先，將36份乳樣進(jìn)行待分離細(xì)菌的富集，用接種環(huán)蘸取乳樣到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃震蕩培養(yǎng)12h左右。從搖床上取出試管進(jìn)行觀察，看到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基由清亮變渾濁后，在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，置于37℃的恒溫箱中。在麥康凱培養(yǎng)基上挑取單個(gè)典型紅色菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌體的染色特性和形態(tài)。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)，然后進(jìn)行鑒定。

1.2.2 大腸桿菌的生化鑒定

分別在三糖鐵、檸檬酸鹽、M.R、V-P、吲哚、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)12～48h，觀察試驗(yàn)結(jié)果，并做好相關(guān)試驗(yàn)記錄。

1.2.3 分離菌株的16S rRNA鑒定

參照文獻(xiàn)[18]合成16S rRNA PCR擴(kuò)增引物。上游引物：5’-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3’；下游引物：5’-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3’（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，特異性鑒定引物）。

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）操作步驟提取大腸桿菌菌株的基因組DNA。

用基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR法采用20μL反應(yīng)體系：ddH2O 9μL，PCR Mix 8μL，模板2μL，上、下游引物均0.5μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性4min，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。觀察目的條帶的電泳圖像。

1.2.4 耐藥性敏感試驗(yàn)

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上加50μL已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液，用“L”棒涂勻，菌液干燥后，在平板上貼5片不同的藥敏紙片（要分布均勻，以免影響實(shí)驗(yàn)），紙片的制作標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS（美國(guó)國(guó)家臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）；試驗(yàn)方法參考《獸醫(yī)微生物學(xué)》[19]，放置溫箱培養(yǎng)20h左右測(cè)量抑菌環(huán)直徑，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷該株菌對(duì)抗菌藥的敏感性[20]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離與鑒定

分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上劃線，放37℃恒溫培養(yǎng)18h左右后觀察培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，菌株在麥康凱培養(yǎng)基上形成大腸桿菌典型的形態(tài)特征：圓形、紅色、表面光滑、隆起、濕潤(rùn)、菌落周邊成淡淡的白色云霧狀，直徑大小為1.0～2.5mm的菌落（圖1）；把分離到的細(xì)菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，可見紅色、革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（圖2）；分離到的細(xì)菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后形成圓形、隆起、表面光滑、帶有金屬光澤的菌落，測(cè)量其直徑為1.0～2.0mm（圖3）。統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，患奶牛乳房炎乳樣中分離到20株疑似大腸桿菌。

圖1 分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

圖2 顯微鏡觀察結(jié)果

2.2 生化鑒定結(jié)果

分離的細(xì)菌可在三糖鐵斜面上產(chǎn)酸（斜面變黃）、產(chǎn)氣、不產(chǎn)生H2S，均可以發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖，而有3株不能分解蔗糖；M.R反應(yīng)試驗(yàn)為紅色，判為陽性；V-P反應(yīng)試驗(yàn)陰性；吲哚反應(yīng)試驗(yàn)呈紅色，判為陽性；檸檬酸鹽反應(yīng)試驗(yàn)陰性。根據(jù)細(xì)菌鑒定方法，對(duì)分離細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果符合有關(guān)大腸桿菌的生化特性[21]。

2.3 分離株的16S rRNA鑒定

對(duì)該20株奶牛乳房炎大腸桿菌分離株采用特異性引物擴(kuò)增后，均得到了與預(yù)期目的片段大小一致的條帶（202 bp），見圖4、圖5。

圖4 大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定

圖5 大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定

2.4 耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從石河子地區(qū)某規(guī)?；膛?chǎng)得到的20株大腸桿菌對(duì)各抗菌藥的耐藥性差異很大，從0.00%～100.00%不等；對(duì)強(qiáng)力霉素（DO）、青霉素（P）、林可霉素（CD）、阿洛西林（AZL）、桿菌肽（B）、紅霉素（E）的耐藥率均高于50%，對(duì)阿洛西林（AZL）的耐藥率則高達(dá)90.00%，而對(duì)紅霉素（E）、青霉素（P）的耐藥率分別為95.00%和90.00%，對(duì)林可霉素（CD）、桿菌肽（B）的耐藥率甚至可達(dá)到了100%，而分離菌株對(duì)氟苯尼考（FFC）、優(yōu)立新（SAM）、頭孢曲松（CTRX）三種藥物都有較好的敏感性，大多數(shù)菌株對(duì)新霉素（N）表現(xiàn)為既不耐受也不敏感（表1）。

表1 20種抗菌藥物對(duì)20株大腸桿菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

表2 20株大腸桿菌多重耐藥型分析結(jié)果

3 討論與分析

經(jīng)對(duì)采集的乳樣進(jìn)行分離鑒定，本試驗(yàn)共分離出20株菌株，通過形態(tài)學(xué)特征觀察、生化特性鑒定、16S rRNA鑒定，最終確定20株分離菌均為大腸桿菌。

大腸桿菌性乳房炎早在1896年就有報(bào)道，其是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一，將分離的大腸桿菌涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性、粗短、兩端鈍圓的小桿菌。常見的大腸桿菌血清型有O2、O8、O21、O81、O86。

大腸桿菌常被稱為“條件性致病菌”，引起大腸桿菌性乳房炎的原因是多方面的，如牛舍環(huán)境、擠奶操作、遺傳等。牛舍中的糞污應(yīng)及時(shí)清理，盡量保持牛舍的通風(fēng)干燥，避免環(huán)境中的大腸桿菌對(duì)奶牛乳房的威脅；擠奶操作要嚴(yán)格規(guī)范，做好擠奶前后乳房的消毒工作，避免機(jī)械設(shè)備損傷乳房。奶牛源大腸桿菌的血清型是比較復(fù)雜的，常具有地域性的不同差異，并且大腸桿菌引起奶牛乳房炎的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。奶牛乳房感染大腸桿菌的原因主要是飼養(yǎng)環(huán)境差和奶牛自身的抵抗力下降。致病性大腸桿菌侵入機(jī)體乳汁、血液和淋巴液而引起的乳房組織炎癥反應(yīng)，常呈急性經(jīng)過，并且多見于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰期。

20世紀(jì)40年代，抗生素被發(fā)現(xiàn)，并逐漸得到廣泛應(yīng)用，在過去的幾十年中對(duì)奶牛乳房炎的治療起到了非常重要的作用。20世紀(jì)末至今，食品安全問題備受大家關(guān)注，也曾出現(xiàn)過諸多食品安全事件，其中不少是出現(xiàn)在畜牧生產(chǎn)環(huán)節(jié)的。我國(guó)加入WTO以后，食品安全問題更被提升到了另一個(gè)新的高度。

目前，抗生素療法仍在奶牛乳房炎治療中起主導(dǎo)作用。然而，不合理使用抗生素會(huì)帶來新的更為嚴(yán)重的問題：致病菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥譜也變廣[22]。通過本試驗(yàn)分離的20株大腸桿菌對(duì)20種抗生素的藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該20株大腸桿菌對(duì)其中的絕大多數(shù)抗生素均產(chǎn)生了耐藥性，而對(duì)林可霉素、桿菌肽、青霉素及紅霉素的耐藥性尤高。這提示我們，在牛場(chǎng)的用藥中要選擇敏感的藥物，如氟苯尼考（FFC）、優(yōu)立新（SAM）、頭孢曲松（CTRX），且要交替使用，以免細(xì)菌對(duì)某一類抗生素產(chǎn)生耐藥性。倪春霞等在2010年也報(bào)道過川、甘、蒙3省區(qū)致奶牛乳房炎大腸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素嚴(yán)重耐藥，對(duì)喹諾酮類抗生素高度敏感[23]；Sumathi等在2008年報(bào)道奶牛源大腸桿菌可對(duì)新霉素、氨芐西林產(chǎn)生耐藥性[24]。徐繼英等在2012年對(duì)國(guó)內(nèi)7個(gè)省份的部分地區(qū)的奶牛乳源大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性分析，該研究與石河子地區(qū)的大腸桿菌對(duì)復(fù)方新諾明和阿莫西林耐藥性上存在一定差異[25]；姚偉等在2016年對(duì)遼寧地區(qū)規(guī)模奶牛場(chǎng)乳房炎大腸桿菌的藥物敏感性測(cè)試的結(jié)果顯示，試驗(yàn)的大腸桿菌分離株對(duì)磺胺類藥物、氯霉素類藥物表現(xiàn)出高耐藥性，對(duì)磺胺二甲氧嘧啶的耐藥率高達(dá)80%[26]；武軍元等[27]在2017年對(duì)新疆阿克蘇地區(qū)分離的大腸桿菌進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)氨芐西林的耐藥性最高，耐藥率為50%，對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素和鏈霉素的耐藥性次之，耐藥率為40%，這說明不同地區(qū)大腸桿菌的耐藥性存在一定差異，可能與抗生素的使用種類、頻率等有一定關(guān)系。更多試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎大腸桿菌對(duì)多種藥物已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與抗菌藥物的長(zhǎng)期或頻繁使用有重要關(guān)系[28]。

本試驗(yàn)從36份乳房炎乳樣中分離到20株大腸桿菌，分離率高達(dá)55.56%（20/36），與姚偉等[29]對(duì)遼寧某規(guī)模化奶牛場(chǎng)進(jìn)行的大腸桿菌性乳房炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果（58.7%）相似。通過國(guó)內(nèi)外有關(guān)大腸桿菌引起奶牛乳房炎的報(bào)道，可以得知大腸桿菌性乳房炎在全球普遍存在。從大腸桿菌分離情況看，該規(guī)模化奶牛場(chǎng)的奶牛乳房炎的致病菌中存在大腸桿菌，且感染率偏高。

大腸桿菌也是引起犢牛腹瀉的一種比較常見的致病菌。從該奶牛場(chǎng)的犢牛養(yǎng)殖來看，犢牛腹瀉比較普遍，也許與該奶牛場(chǎng)大腸桿菌乳房炎高發(fā)有一定的關(guān)系。建議及時(shí)預(yù)防大腸桿菌性乳房炎和犢牛腹瀉，采取及時(shí)有效的措施，在使用抗生素防治大腸桿菌引起的疾病時(shí)，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)格遵守相關(guān)的用藥規(guī)范[30]。