豬肺炎支原體強毒株的分離和鑒定

姜來生，張 洪，杜德燕，方鵬飛，郭建寶

（四川省華派生物制藥有限公司，四川 簡陽 641400）

豬肺炎支原體是豬支原體肺炎（MPS）（又稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎）的病原，是一種介于細菌和病毒之間的原核微生物。豬喘氣病是一種高傳染性、接觸性、高發(fā)病率和低死亡率的慢性呼吸道病，而且很容易繼發(fā)其他病原感染，最終形成慢性肺炎。該病流行范圍廣，且難以治愈，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是世界上最主要的豬病之一。本試驗從疑似豬支原體肺炎病例病料中分離、培養(yǎng)并鑒定獲得了1株豬肺炎支原體強毒株,并進行了部分基因序列測序分析，為后續(xù)豬肺炎支原體研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病豬病料 疑似豬支原體肺炎的發(fā)病豬病料采集自四川地區(qū)部分豬場。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良A26培養(yǎng)基由四川省華派生物制藥有限公司研發(fā)配制。

1.1.3 主要試劑 2×Taq PCR MasterMix、Maker III，購自TIANGEN生物科技公司；豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司；豬圓環(huán)病毒ELISA抗體檢測試劑盒，購自Biocheck公司；豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒，購自法國LSI公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 參照劉茂軍等的方法，無菌采集疑似病例的豬肺進行無細胞分離培養(yǎng)。

1.2.2 染色鏡檢 取培養(yǎng)物涂片，用革蘭氏染色液和瑞氏染色液進行染色觀察。

1.2.3 顏色變化單位（CCU）的測定 參照王繼春介紹的方法，取菌種依次以1∶10遞減稀釋，稀釋至10-11；設(shè)本培養(yǎng)基作對照，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每日觀察一次，直至21d。

1.2.4 PCR鑒定 根據(jù)Genbank中公布的豬肺炎支原體基因組序列設(shè)計一對特異性引物，并提交給Invitrogen公司合成，引物序列為 P1：5′-TTACAGCGGGAAGACC-3′，P2：5′-CGGCGAGAAACTGGATA-3′。將經(jīng)培養(yǎng)傳代試驗和染色鏡檢試驗鑒定為豬肺炎支原體的培養(yǎng)物按文獻方法提取基因組DNA，進行PCR擴增，擴增結(jié)束后取產(chǎn)物5μL在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳檢測。

1.2.5 測序分析 PCR產(chǎn)物送往Invitrogen公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的4個國際主要代表株的相應(yīng)序列進行比較分析。用于比較的參考毒株名稱及其在GenBank 中的登陸號為：J（NCO07295）、168（NC017509）、232（NC006360）、7448（NC007332）。

1.2.6 菌株的致病性試驗 從健康的長白二元雜交豬中篩選出豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征4種病的抗原及抗體均呈陰性的試驗豬，將經(jīng)培養(yǎng)傳代試驗、染色鏡檢試驗和測序檢測鑒定為豬肺炎支原體的新鮮培養(yǎng)物按合適劑量以氣管注射的方式接種 3頭（編號 1、2、3）試驗豬，同時設(shè) 2頭（編號4、5）氣管注射A26培養(yǎng)基的豬作為對照組。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無抗生素。逐日觀察至25 d，再剖檢試驗豬，根據(jù)55分評分法對試驗豬的肺部病變進行評分。

1.2.7 攻毒豬病變肺中支原體的再分離 操作同1.2.1的方法一樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肺炎支原體的分離與形態(tài)觀察 從15份疑似豬支原體肺炎的豬肺病料中分離培養(yǎng)獲得1株病原。將分離株接種到A26培養(yǎng)基培養(yǎng)后，培養(yǎng)基變黃，pH值下降；將培養(yǎng)物涂片，瑞氏染色、鏡檢，觀察到特征性的多形態(tài)菌體，有點狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀，無雜菌污染。連續(xù)傳代至20代，其培養(yǎng)特性和病原形態(tài)皆穩(wěn)定。

2.2 顏色變化單位（CCU）的測定結(jié)果 將培養(yǎng)傳代至第5代的培養(yǎng)物稀釋至10-11，共11個梯度，觀察顏色變化單位，至 21d 時，CCU 達到 1×109。

2.3 PCR鑒定結(jié)果 由圖1可見，傳代培養(yǎng)物與攻毒后再分離培養(yǎng)的培養(yǎng)物的PCR擴增結(jié)果，均與豬肺炎支原體J株P(guān)CR的擴增結(jié)果大小一致，并與預(yù)期片段427bp大小一致。

圖1 PCR鑒定擴增結(jié)果

2.4 序列分析 測序結(jié)果經(jīng)NCBI-Blast和DNAStar比對分析，發(fā)現(xiàn)目的序列與J株序列（基因號：NC007295）相比，在第8個堿基處多一個G堿基；與168株序列（基因號：NC017509）則反向互補，并在第8個堿基處多一個G堿基，在第382個堿基處不一致；與232株序列（基因號：NC006360）比對，發(fā)現(xiàn)在第8個堿基處多一個G堿基，在第27、171、350個堿基處均不一致；與7448株序列（基因號：NC007332）比對，發(fā)現(xiàn)在第8個堿基處多一個G堿基，在第381個堿基處不一致。測序結(jié)果如下：

TTACAGCGGGGAAGACCACAAAAACCGGGTGAAA CTCGGCTTGAATTAGTAGCTGATAACATCCGAATTATC CGGGAAATTGCACTAAAAGTCAAAGAAAGTGGCTTTA GTGGAATAAGTATTATTGTTGCTAATCCTGTTGATATA ATTACAAGGGCTTACCGGGATGCATCTGGATTTTCCGA TCAAAAAGTTATCGGTAGTGGAACTGTTTTAGATACAG CAAGGCTTCAATTTGCAATCGCAAAAAGAGCAAAAGT ATCGCCTAATTCGGTTCAGGCCTACGTGATGGGTGAAC ATGGTGATTCATCTTTTGTTGCTTATTCAAATATTAAAA TTGCCGGTGAATGTTTCTGTGCTTATTCTAAACTAACCG GAATTGATAGCTCAAATTACGAAAAAGAACTTGAATAT CCAGTTTCTCGCCG

2.5 動物回歸實驗結(jié)果 在長白二元雜交豬氣管內(nèi)注射合適劑量的分離株新鮮培養(yǎng)物后，豬出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀。注射后15d、25d采血檢測抗體，結(jié)果試驗組都為抗體陽性，對照組為抗體陰性；25d剖檢攻毒豬，發(fā)現(xiàn)肺臟的尖葉、心葉、中間葉或膈葉前緣有不同程度的特征性病變，呈“肉樣”或“蝦肉樣”。臨床癥狀及病變評分見表1。

2.6 攻毒豬病變肺中支原體的再分離 將攻毒病變豬的肺組織病料經(jīng)分離、傳代培養(yǎng)后，顯示pH值下降；涂片染色鏡檢，觀察到特征性的多形態(tài)菌體，有點狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀，無雜菌污染；PCR鑒定結(jié)果見圖1。

表1 動物回歸實驗肺部病變評分

3 小結(jié)與討論

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引起的慢性、接觸性呼吸道疾病，豬肺炎支原體在自然界中長期存在，豬感染后久治難愈，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的危害。1973年，上海畜牧獸醫(yī)研究所首次將病豬的肺組織通過豬肺埋塊細胞培養(yǎng)法分離得到一株致病性豬肺炎支原體，此后廣東、廣西等8個省、自治區(qū)亦相繼分離到此病原。本試驗從15份豬疑似支原體肺炎的臨床病料中分離到1株毒株，經(jīng)培養(yǎng)傳代、染色鏡檢、PCR鑒定及測序分析，鑒定為豬肺炎支原體。分離株在攻毒健康豬后出現(xiàn)典型的豬支原體肺炎臨床癥狀和病變，并從病變肺中又分離到了該毒株，說明所分離的毒株不僅是豬肺炎支原體，而且該分離株對豬具有一定的毒力。

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