電針對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及額葉皮質(zhì)SIRT1/FOXO3a表達(dá)的影響*

光 磊 王 智 許志鵬 葉 偉 王 林 丁 見

皖南醫(yī)學(xué)院 1 臨床醫(yī)學(xué)院2016級 2 人體解剖學(xué)教研室，安徽省蕪湖市 241002

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力減退為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)AD的因素有tau蛋白過度磷酸化形成的胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集等[1]。在大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)可降低葡萄糖在大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)的代謝速度，導(dǎo)致Aβ的異常聚集，進(jìn)而突觸丟失、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，最終出現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1 (Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)可通過增強(qiáng)α-分泌酶的活性或抑制NF-κB信號通路來減少β-淀粉樣蛋白的病理性沉積，其激活后可改善AD大鼠海馬區(qū)認(rèn)知障礙,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,故被認(rèn)為是預(yù)防和改善AD的重要靶基因[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a (Forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a)是叉頭框蛋白O家族的核心,具有抗氧化、抗應(yīng)激損傷等多種生物學(xué)功能[4]。AD的治療目前尚無特效手段, 但有報(bào)道顯示電針對改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶功能具有明顯的療效[5]。由SIRT1、FOXO3a基因在神經(jīng)元中表達(dá)的結(jié)果進(jìn)一步表明SIRT1、FOXO3a在AD的改善中起著非常重要的作用，這將對AD的研究及診治具有深遠(yuǎn)的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 從浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心[動物證書編號：SCXK(浙江)2014-0001]購買18只雄性SD大鼠，體重(200±20)g。實(shí)驗(yàn)期間，為大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、自然光照，飼養(yǎng)室恒溫21～25℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將健康SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和電針組，每組6只。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的操作和處理嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的有關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ-S0130)購自Sigma公司；腦立位定位儀(上海江灣醫(yī)療器械廠)；通透液(P0097-100ml)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；Nisslstaining溶液購自北京索萊寶科技有限公司；兔IgG-免疫組化試劑盒(SABC濃縮型)(SA2002 1/4KIT)、SIRT1抗體購自博士德生物工程有限公司；FOXO3a抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(型號：RM2235，德國Leica公司)；微量注射器(上海安亭進(jìn)樣器廠)；BX 51顯微鏡；Express C圖像分析系統(tǒng)(日本，OLYMPUS)。

1.3 制備AD模型及模型后治療 造模：通過Morris水迷宮的試驗(yàn)篩選學(xué)習(xí)記憶功能正常的12只大鼠作為模型組和電針組，每組6只，以3ml/kg腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉后將頭部固定在腦立體定位儀上，剪去頭部鼠毛，消毒，再沿矢狀線切開約1.5cm，推開兩側(cè)骨膜暴露顱骨，微量加樣器垂直進(jìn)入腦室，在大鼠兩側(cè)側(cè)腦室緩慢注射STZ(100mg/ml)，距腦表面為3.6mm，注射時(shí)間為2min，留針3min，注射后緩慢拔出微量加樣器，使用無菌骨蠟來封閉鉆孔，再縫合消毒，防止大鼠感染死亡。若模型組大鼠4d平均逃避潛伏期高于對照組(P<0.05)，平臺象限滯留時(shí)間百分比低于對照組(P<0.05)，提示造模成功。對照組緩慢注射等量人工腦脊液(100mg/ml)，與上述相同處理。治療：造模成功1周后，將電針組以3ml/kg腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉成功后將大鼠側(cè)臥位放置，針柄連接至電針儀，正極連接“大椎”穴，負(fù)極連接左側(cè)“百會”穴，在頂骨正中向后平刺“大椎”穴2mm，在腓骨小頭下方約5mm 處直刺左側(cè)“百會”穴2mm，用頻率為2Hz，強(qiáng)度為2V，波寬為1ms的電針連續(xù)治療14d，30min/次，1次/d。對照組和模型組不予治療。

1.4 Morris水迷宮 水迷宮檢測實(shí)驗(yàn)共5d，分為定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮由圓形水池(半徑60cm，高度60cm)和平臺(直徑9cm，放置于水下2cm)構(gòu)成，水池被分為1、2、3、4四個象限，本實(shí)驗(yàn)平臺位于第4象限。實(shí)驗(yàn)前1d，先將大鼠放到平臺適應(yīng)10s，再以第2象限為入水點(diǎn)，預(yù)游泳120s。之后的第1～4天，將大鼠分別從4個象限固定點(diǎn)面壁放入水中,記錄每只大鼠找到平臺的時(shí)間，即為逃避潛伏期。計(jì)時(shí)120s，若在平臺滯留超過5s定義為找到平臺。若滯留不足5s，則該鼠的逃避潛伏期記作120s，并將大鼠引至平臺，停留10～15s。每只大鼠每天4個象限找到平臺的時(shí)間取平均值作為該鼠當(dāng)天的成績，即為平均逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第5天把平臺撤去, 按照上述方法把大鼠從4個象限依次面壁放入水中，記錄120s內(nèi)大鼠在平臺象限的滯留時(shí)間和穿越原平臺的次數(shù)。此實(shí)驗(yàn)均在水溫(22±2)℃、黑暗環(huán)境中進(jìn)行。

1.5 尼氏染色和免疫組化染色

1.5.1 取材：3ml/kg腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉后備皮、消毒，從劍突下打開大鼠胸腔，暴露心臟，從心尖處插入吊瓶針至主動脈弓處，先注入100ml生理鹽水，再注入300ml已過濾的多聚甲醛固定液(前100ml快速注入，剩余200ml緩慢注入)，固定后取腦組織，將取出的腦組織放入4℃ 4%多聚甲醛固定液浸泡24h，再經(jīng)過脫水、石蠟包埋后，將蠟塊保存在4℃冰箱。

1.5.2 尼氏染色：參考《大鼠腦立體定向圖譜Ⅲ》，取大鼠額葉皮質(zhì)所在區(qū)段制備的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，于Cresyl Violet Stain中56℃浸泡1h，去離子水沖洗，置于Nissl分化幾秒鐘，光學(xué)顯微鏡下觀察額葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)，二甲苯透明，并用中性樹膠密封，1周內(nèi)采圖。

1.5.3 免疫組化：取大鼠額葉皮質(zhì)所在區(qū)段制備的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，放入3%雙氧水室溫10min，pbs沖洗5min×2次，枸櫞酸中修復(fù)，冷卻，通透液37℃溫箱恒溫45min，pbs沖洗5min×2次，山羊血清封閉液滴加，37℃溫箱恒溫1.5h。滴加稀釋過的一抗SIRT1(1∶1 000)、FOXO3a(1∶1 000)，4℃冰箱過夜，再放入37℃溫箱恒溫1h，pbs沖洗5min×3次，滴加二抗生物素化兔抗山羊IgG(1∶100)、羊抗兔IgG(1∶100)，37℃溫箱恒溫2h，pbs沖洗5min×3次，滴加SABC 37℃溫箱恒溫1h，pbs沖洗5min×3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察額葉皮質(zhì)神經(jīng)元，清水沖洗載玻片，烘干，二甲苯脫水、透明，中性樹膠封片，1周內(nèi)采圖。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮結(jié)果 見圖1。模型組大鼠4d平均逃避潛伏期高于對照組(P<0.05)，平臺象限滯留時(shí)間百分比低于對照組(P<0.05)；電針組大鼠的4d平均逃避潛伏期低于模型組(P<0.05)，平臺象限滯留時(shí)間百分比高于模型組(P<0.05)；電針組大鼠的4d平均逃避潛伏期高于對照組(P<0.05)，平臺象限滯留時(shí)間百分比低于對照組(P<0.05)。

圖1 Morris水迷宮

2.2 尼氏染色結(jié)果 見圖2。對照組額葉皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞核居中，核仁清楚，神經(jīng)細(xì)胞緊密(圖2對照組)；模型組大腦皮質(zhì)發(fā)生萎縮，體積明顯小于對側(cè)，額葉出現(xiàn)結(jié)構(gòu)、形態(tài)的變化，神經(jīng)元層次明顯紊亂，染色加深，細(xì)胞核固縮(圖2模型組)；電針組較模型組神經(jīng)元形態(tài)明顯改善，情況好轉(zhuǎn)(圖2電針組)。

圖2 尼氏染色×400

2.3 免疫組化結(jié)果 見圖3。SIRT1陽性神經(jīng)元呈棕黃色，免疫陽性產(chǎn)物著色部位主要是胞膜和胞漿。與對照組相比，模型組的SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，免疫陽性細(xì)胞平均灰度值增加(P<0.05)；與模型組相比，電針組的SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量增加，免疫陽性細(xì)胞平均灰度值降低(P<0.05)。FOXO3a陽性神經(jīng)元呈棕黃色，免疫陽性產(chǎn)物著色部位主要是胞膜和胞漿，細(xì)胞多呈圓形或梨形。與對照組相比，模型組的FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，多位于胞漿，染色加深，平均灰度值降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組的FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量減少，著色淺，多位于胞核，平均灰度值增高(P<0.05)。

圖3 SIRT1和FOXO3a表達(dá)情況

3 討論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要表現(xiàn)是學(xué)習(xí)記憶功能障礙，導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量明顯下降，目前尚無有效治療的方法。在AD的發(fā)病機(jī)制中，由于Aβ神經(jīng)元毒性、氧化應(yīng)激、突觸功能異常、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)與神經(jīng)元損害等一系列交叉級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦組織萎縮、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能破壞[6]。其主要病理學(xué)改變包括腦組織大量神經(jīng)元丟失、突觸改變、細(xì)胞外老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成[7]，即細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。尼氏染色觀察到模型組大腦皮質(zhì)發(fā)生萎縮，體積明顯小于對側(cè)，額葉出現(xiàn)結(jié)構(gòu)、形態(tài)的變化，神經(jīng)元層次明顯紊亂，染色加深，細(xì)胞核固縮；Morris水迷宮試驗(yàn)系統(tǒng)檢測到模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯高于對照組(P<0.05),平臺象限滯留時(shí)間百分比低于對照組(P<0.05)，提示AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害嚴(yán)重，造模成功。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (Silent information regulator 1,SIRT1)是sirtuins去乙?；讣易宄蓡T，因?yàn)镾IRT1對不同類型的底物進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，故表現(xiàn)出廣泛的功能，如能量代謝、脂肪代謝、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞衰老、胰島素分泌和糖原代謝等[8]。叉頭基因轉(zhuǎn)錄因子家族(Forkhead transcription factor,FOXO)，又稱Forkheadlike protein(FKHR)，該家族包括4種蛋白：FOXO1/FKHR/FOXO1a、FOXO3/FKHRL1/FOXO3a、FOXO4/AFX和FOXO6，它們的結(jié)構(gòu)、功能及作用比較相似，都是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)、能量代謝和長壽、癌癥的發(fā)生發(fā)展及其他的細(xì)胞功能有關(guān)的一類蛋白質(zhì)家族體系。其中，F(xiàn)OXO3a是其蛋白家族重要的成員之一[9]。多項(xiàng)研究顯示[10-13]：SIRT1可通過去乙?；疐OXO3a來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞抗氧化的基因和酶的表達(dá)，從而減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物對細(xì)胞的損傷，由此延緩細(xì)胞的衰老與凋亡，保護(hù)細(xì)胞的正常功能[14]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組的SIRT1陽性表達(dá)最弱，F(xiàn)OXO3a陽性表達(dá)最強(qiáng)，而在對照組中SIRT1陽性表達(dá)最強(qiáng)，F(xiàn)OXO3a陽性表達(dá)最弱。這與SIRT1可以通過去乙酰化FOXO3a來減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物對細(xì)胞的損傷的觀點(diǎn)相一致。

據(jù)研究顯示電針具有改善循環(huán)、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)受損神經(jīng)和腦組織、提高機(jī)體抵抗自由基能力等作用[15]，使用電針治療AD的機(jī)理之一是干預(yù)Aβ的生成途徑，即調(diào)控β分泌酶的表達(dá)，抑制淀粉樣前體蛋白APP的異常水解[16]，減少Aβ的沉積，進(jìn)而有效控制AD的發(fā)生。陳陽陽等[17]和董衛(wèi)國等[18]電針AD大鼠“大椎”穴和“百會”穴，與模型組對比發(fā)現(xiàn)電針組小鼠大腦皮層及海馬的 APP與Aβ明顯減少，說明電針“大椎穴”和“百會穴”有助于抑制AD的發(fā)生。張曉東和佟欣等[19-20]實(shí)驗(yàn)表明，通過對AD大鼠電針刺激“大椎”穴和“百會”穴，可在一定程度上改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本實(shí)驗(yàn)中，電針組大鼠的平均逃避潛伏期低于模型組(P<0.05)，平臺象限滯留時(shí)間百分比高于模型組 (P<0.05)，說明通過電針治療后AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到改善；電針組的SIRT1陽性表達(dá)比模型組強(qiáng)，F(xiàn)OXO3a陽性表達(dá)比模型組弱，故電針改善了蛋白表達(dá)量，促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，抑制FOXO3a的表達(dá)，而SIRT1可以通過去乙酰化FOXO3a，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物對細(xì)胞的損傷,改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。因此電針對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善效果，但具體的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究和發(fā)現(xiàn)。