MiR-338及PTN的表達(dá)與卵巢癌的臨床診斷價(jià)值的研究*

吳大英 黃 震 張秀艷 李 霞 郭予武 武紅梅

1 廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116； 2 深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)是卵巢惡性腫瘤中最常見的組織類型，占卵巢惡性腫瘤90%以上，腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響上皮性卵巢癌患者生存率的主要因素[1]，病死率高居?jì)D科惡性腫瘤之首[2-3]。但由于其發(fā)病隱匿且缺乏早期診斷方法，多數(shù)患者確診時(shí)已表現(xiàn)為腹腔內(nèi)廣泛播散和轉(zhuǎn)移[4]。因此尋找預(yù)測其侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

越來越多的證據(jù)顯示miRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移中都起到了重要作用。研究也證實(shí) microRNA 在多種腫瘤如卵巢癌、肺癌等異常表達(dá)，和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。Yuting Z等[5]發(fā)現(xiàn)miR-338在卵巢癌發(fā)病過程中通過調(diào)控PKM2的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和代謝。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PTN在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[6]。但國內(nèi)尚未見卵巢癌MiR-338及PTN表達(dá)之間相互關(guān)系的研究文獻(xiàn)報(bào)道。本文作者應(yīng)用免疫組化方法檢測卵巢癌組織、卵巢良性病變組織及卵巢交界性病變組織中MiR-338及PTN的表達(dá)，同時(shí)ELISA 檢測以上三類患者血清中MiR-338及PTN含量，旨在研究MiR-338及PTN在卵巢癌中表達(dá)水平及其對(duì)EOC的臨床診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究中的所有材料均來自深圳市龍崗中心醫(yī)院手術(shù)切除組織，標(biāo)本獲取時(shí)間為2016年1月—2019年2月，包括70例卵巢良性病變組織、80例卵巢交界性病變組織和70例卵巢癌組織，通過石蠟包埋保存。以上三類基本病理及臨床信息分別為：(1) 70例卵巢良性病變組織，其中單純性囊腫30例(42.85%)，腺纖維瘤40例(57.14%)；(2) 80例卵巢交界性病變組織，其中漿液性囊腺癌38例(47.5%)，黏液性囊腺癌42例(52.5%)；(3) 70例卵巢癌組織，其中黏液性囊腺癌25例(35.7%)，子宮內(nèi)膜樣癌45例(64.3%)。根據(jù)其發(fā)病機(jī)制及分子遺傳特點(diǎn)又可以分為兩型：Ⅰ型腫瘤和Ⅱ型腫瘤。其中，Ⅰ型腫瘤包括了低級(jí)別漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌等；Ⅱ型腫瘤包括了高級(jí)別漿液性癌、癌肉瘤及未分化癌。按照國際抗癌協(xié)會(huì)建議的TNM分期法將卵巢癌組患者分為T、N、M期，T1、T2、T3分別為17例(24.3%)、10例(14.3%)、8例(11.4%)；N0、N1期分別為12例(17.1%)、5例(7.1%)；M0、M1期分別為7例(10.0%)、11例(15.7%)；腫瘤直徑<5cm的42例(60.0%)，腫瘤直徑>5cm的28例(40.0%)。本研究經(jīng)深圳市龍崗中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化S-P法檢測MiR-338及PTN蛋白表達(dá)： 取外科手術(shù)切除的70例卵巢良性病變組織、80例卵巢交界性病變組織和70例卵巢癌組織，均制備石蠟塊標(biāo)本，卵巢良性病變組織蠟塊標(biāo)本作正常對(duì)照。免疫組化染色采用ABC法，DAB顯色，所有實(shí)驗(yàn)操作均按博士德試劑公司說明書。用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×200),每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞。將細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分(無，0分；弱，1分；中度，2分，強(qiáng)度，4分)和陽性細(xì)胞率評(píng)分(<5%,0分；6%～10%，1分；11%～20%，2分；21%～50%，3分；>51%，4分)之和為該病例評(píng)分值，且將評(píng)分值≤1分定為陰性病例，>2分定為陽性病例。以博士德公司提供的陽性切片作為兩者染色的陽性對(duì)照，以0.01M PBS液(pH7.4)代替一抗作為每次染色的陰性或替代對(duì)照。

1.2.2 血清MiR-338及PTN的檢測： 取待檢者清晨空腹靜脈血5ml，離心(3 000r/min,8～10min),分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA法測定血清MiR-338及PTN水平，按深圳晶美生物技術(shù)公司試劑說明書操作，所有操作嚴(yán)格按試驗(yàn)說明書流程進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 卵巢良性病變組織、卵巢交界性病變組織及卵巢癌組織中MiR-338及PTN蛋白表達(dá) MiR-338及PTN免疫組化反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于胞膜和(或)胞漿，少部分病例偶見胞核也著色，出現(xiàn)棕黃色顆粒，背景不著色。兩者在癌組織中分布呈較明顯異質(zhì)性，同一切片不同癌巢或同一癌巢不同細(xì)胞著色強(qiáng)度或陽性細(xì)胞率也較明顯不同。70例卵巢良性病變組織MiR-338及PTN陽性病例分別為3例(4.3%),5例(7.1%)，其評(píng)分值分別為0.6±0.2和0.8±0.2；80例卵巢交界性病變組織MiR-338及PTN陽性病例分別為7例(8.8%)、8例(10.0%),其評(píng)分值分別為1.1±0.4和1.3±0.3； 70例卵巢癌組織MiR-338及PTN陽性病例分別為43例(61.4%)、47例(67.1%)，其評(píng)分值分別為5.0±1.2和5.7±1.1；卵巢癌組織MiR-338及PTN表達(dá)陽性率及其評(píng)分均顯著高于卵巢良性病例及卵巢交界性病變組織，卵巢癌組織中MiR-338及PTN 陽性率經(jīng)過χ2檢驗(yàn)分析(χ2=30.13,P=0.015；χ2=23.50,P=0.017)明顯高于卵巢良性病例及卵巢交界性病變組織，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖1～3。

圖1 卵巢良性病變組織MiR-338、PTN的表達(dá)(×200)

圖2 卵巢交界性病變組織MiR-338、PTN的表達(dá)(×200)

2.2 卵巢良性病變組、卵巢交界性病變組及卵巢癌組三組患者血清中MiR-338及PTN表達(dá)水平 ELISA檢測結(jié)果顯示，卵巢癌組血清MiR-338及PTN表達(dá)水平顯著高于卵巢良性病變組和卵巢交界性病變組，P分別為0.020和0.024。結(jié)果見表1。

2.3 MiR-338及PTN的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的分析 檢測結(jié)果顯示MiR-338及PTN表達(dá)水平隨TNM分級(jí)的增高而增加，且表達(dá)水平隨著腫瘤直徑增大而增加(P<0.05)，MiR-338及PTN兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.89)。結(jié)果見表2。

表2 70例不同病理類型卵巢癌患者中MiR-338及PTN的表達(dá)水平及相關(guān)性分析

3 討論

卵巢癌是當(dāng)前死亡率較高的婦科惡性腫瘤之一，手術(shù)輔以化療是其主要的治療方法。然而化療耐藥嚴(yán)重影響了卵巢癌患者的化療效果和生存質(zhì)量，使卵巢癌5年生存率長期維持在20%～30%[7]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，探索影響EOC侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)細(xì)胞分子以及潛在的作用分子機(jī)制，為臨床防治提供更準(zhǔn)確而早期的診斷信息，一直是人們潛心研究的重要課題和努力方向[8]。

越來越多的證據(jù)顯示MiRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮了重要作用。研究也證實(shí) microRNA 在多種腫瘤如卵巢癌、結(jié)直腸癌、白血病、前列腺癌、胃、肝癌和肺癌等異常表達(dá)，和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[9]。

PTN是一種分泌性生長因子，在發(fā)育成熟的組織中一般不表達(dá)或極少表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PTN 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、絨癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和黑色素瘤等腫瘤中呈高表達(dá)，在上述這些腫瘤組織中內(nèi)源性的基因持續(xù)活化，而在相應(yīng)的非瘤組織中很難檢測到 PTN 的表達(dá)[6，10-11]。

本文研究結(jié)果顯示，利用免疫組化檢測70例卵巢良性病變組織、80例卵巢交界性病變組織和70例卵巢癌組織的MiR-338及PTN表達(dá)，卵巢癌組織MiR-338及PTN蛋白定位于腫瘤細(xì)胞胞漿及胞膜，陽性表達(dá)為胞漿或胞膜染為棕黃色，呈彌漫或散在的顆粒狀。癌間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)，癌旁組織幾乎不表達(dá)。癌周淋巴結(jié)主要分布在癌周圍間質(zhì)，尤其是浸潤前緣數(shù)量最多。而MiR-338及PTN表達(dá)陰性者癌周淋巴結(jié)較少，管腔內(nèi)偶見淋巴細(xì)胞，隨PTN表達(dá)強(qiáng)度的增加，癌周淋巴結(jié)也有增加趨勢，癌組織內(nèi)PTN表達(dá)與癌周淋巴結(jié)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，提示腫瘤細(xì)胞可分泌PTN，通過PTN刺激微血管形成，腫瘤增殖速度加快，反映了惡性腫瘤的特征。進(jìn)一步利用免疫組化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行MiR-338及PTN表達(dá)情況的判讀，發(fā)現(xiàn)MiR-338及PTN8在良性病變組織的評(píng)分集中在0～1分之間，在交界性卵巢病變組織的評(píng)分集中在0.8～1.5分之間，而惡性組織中的評(píng)分集中在4～6分之間，按>2分定義為高表達(dá)MiR-338及PTN，可明確惡性腫瘤組織中MiR-338及PTN的表達(dá)高于良性病變組織及交界性病變組織， 因此可以認(rèn)為MiR-338及PTN對(duì)腫瘤組織具有良好的特異性。

本文研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者血清MiR-338及PTN表達(dá)均顯著高于卵巢良性病變患者及卵巢交界性病變患者，二者濃度過高可能是發(fā)生卵巢癌的危險(xiǎn)因素。

然后按照國際抗癌協(xié)會(huì)建議的TNM分期法將卵巢癌組患者分為T1期、T2～3期，N0期、N1期，M0期和M1期。從表2可以看出，經(jīng)方差分析顯示MiR-338及PTN表達(dá)水平隨TNM分級(jí)的增高而增加(P<0.05)，且兩者之間存在呈正相關(guān)關(guān)系，更重要的是，腫瘤直徑>5cm的卵巢癌患者血清中MiR-338及PTN表達(dá)水平明顯高于且腫瘤直徑<5cm的卵巢癌患者。Kim 等[12]學(xué)者通過PCR 技術(shù)和免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測到miR-338在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Chen 等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-338在上皮性卵巢癌中表達(dá)顯著上調(diào)，并且這種上調(diào)與上皮性卵巢癌的病理分化和臨床分期具有相關(guān)性。這些均與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)miR-338可能在EOC中能夠調(diào)控PTN表達(dá)，在卵巢癌中也有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖和侵襲，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和代謝。

目前已公認(rèn)PTN 具有促血管新生、刺激細(xì)胞增殖與遷移等多種生物學(xué)活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PTN在卵巢癌中高表達(dá)且與其侵襲轉(zhuǎn)移能力也有一定的相關(guān)性[14]；PTN促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖和侵襲遷移能力，筆者推測MiR-338及PTN可能參與了卵巢癌血管的病變過程，miR-338與間質(zhì)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管及淋巴管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞外基質(zhì)成分形成腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促使機(jī)體分泌合成PTN等炎癥因子上升，血液中PTN濃度過高導(dǎo)致的血管炎癥因子的持續(xù)刺激，使機(jī)體產(chǎn)生過多的氧自由基，破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抑癌功能慢性喪失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[15]。

綜上所述，miR-338及PTN在EOC增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用。miR-338通過上調(diào)PTN的表達(dá)水平，參與調(diào)控EOC增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，最終影響EOC的進(jìn)展。在EOC發(fā)生發(fā)展過程中miR-338對(duì)PTN潛在的調(diào)控作用機(jī)制值得我們進(jìn)一步研究。