液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定雞肉中恩諾沙星含量的不確定度評價

史 梅

新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830000

恩諾沙星（enrofloxaein，ENR）是一種氟喹諾酮類藥物，是家禽養(yǎng)殖中廣泛使用的抗生素，具有抗菌譜廣、殺菌活性強等優(yōu)點，被廣泛使用，對預防和治療動物細菌性疾病和支原體感染方面具有較高療效[1-2]。然而部分企業(yè)和養(yǎng)殖戶為追求畜禽快速增長及預防其生病而忽略安全添加劑量，無視休藥期等規(guī)范用藥而造成抗生素濫用。忽視用藥規(guī)律而長期濫用抗生素會導致耐藥性[3-6]，最終影響畜禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展和人類的健康。因此，在畜禽產(chǎn)品中檢測氟喹諾酮類藥物含量非常有必要。在檢測分析中，由于受檢測儀器、檢測方法及試驗誤差的影響，檢測值往往低于真實值。如何判定檢測結(jié)果真實有效，不確定度是一個重要的參考指標。不確定度可反映測量結(jié)果的準確性和可靠性[7]，其受諸多因素的影響。然而，1 個試驗的不確定度評價往往較為困難，需要考慮諸多因素和試驗環(huán)節(jié)。本文通過參照中國農(nóng)科院建立的評價《雞蛋和雞肉中氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺殘留測定操作細則》中恩諾沙星的不確定度的方法，及其他相關(guān)技術(shù)文獻和指南[8-9]，評定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）測定雞肉中恩諾沙星含量的不確定度，以期為氟喹諾酮類藥物檢測方法的改進提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters Xevo TQ-S，美國沃特世公司，METTLER TOLEDO MS105DU 萬分之一電子分析天平，METTLER TOLEDO 公司生產(chǎn)；Eppendorf 移液器（20、100、1 000 μL），德國Eppendorf 公司；C18 固相萃取柱（100 mg/3 mL），安捷倫公司生產(chǎn)。恩諾沙星標準品（批號50128，德國Dr 公司，純度98.5%），內(nèi)標為恩諾沙星D5 標準品，乙腈、正己烷、乙酸、甲酸均為色譜純，氫氧化鈉為分析純，水為一級水。

1.2 方 法

1）恩諾沙星測量方法。

①標準品和內(nèi)標工作液的配置。精密稱取恩諾沙星標準品10 mg，用甲醇定容至10 mL 棕色容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標準儲備液，-20 ℃冰箱保存，同位素內(nèi)標配制按如上操作。用移液器將標準品和內(nèi)標儲備液逐級稀釋，最終用流動相定容上機工作液恩諾沙星和內(nèi)標均為20 ng/mL。

②樣品前處理。取2.00 g 雞肉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋提取2 min，10 000 /min 離心5 min，上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，重復提取1 次，合并上清液，50 ℃氮吹至干，加磷酸鹽2 mL 溶解殘渣，C18 固相萃取柱凈化，先用2 mL 乙腈和2 mL 磷酸鹽緩沖液活化平衡，將待凈化液過柱，用2 mL 水淋洗，真空抽干，用1 mL 0.1%甲酸乙腈水溶液洗脫，真空抽干，洗脫液過0.22 μm 濾膜后上機測定。

③色譜條件。

A.色譜柱：BEH C18 1.7 μm ×2.10 mm×50 mm。

B.流速：0.3 mL/min。

C.進樣體積：2 μL。

D.流動相：0.1%甲酸乙腈溶液。

④質(zhì)譜條件。

A.離子源：電噴霧離子源（ESI+）。

B.掃描方式：多反映離子監(jiān)測（MRM）。

C.離子源溫度：600 ℃。

D.離子源噴霧電壓：5 500 V。

⑤結(jié)果計算。

恩諾沙星用恩諾沙星-D5 校準，單點校準，按如下公式計算恩諾沙星含量：

式中：A——待測樣品中恩諾沙星的面積；

A’is——標準品中恩諾沙星內(nèi)標的面積；

As——標準品中恩諾沙星的面積；

Ais——待測樣品中恩諾沙星內(nèi)標的面積；

Cs——標準品中恩諾沙星的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

Cis——樣品中恩諾沙星內(nèi)標的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

C’is——標準品中恩諾沙星內(nèi)標的質(zhì)量濃度（ng/mL）；

V——溶解殘余物所用試樣溶液體積；

m——供試試樣的質(zhì)量（g）。

2）測量不確定度分析。在本試驗的不確定度分析中，首先考慮多次測量引入的不確定度，其次考慮每一步試驗操作中可能影響結(jié)果的步驟操作產(chǎn)生的不確定度，即樣品稱量、標準品配制、定容體積、恩諾沙星標準溶液峰面積和恩諾沙星內(nèi)標峰面積這些因素引入的測量結(jié)果的不確定[10]。

①測量重復性的不確定度的確定。為了得到一個可靠性較高的測量重復性標準偏差，在本次試驗測量中，平行測量6 個試驗樣品，測量值見表1。

6 個樣品恩諾沙星含量的平均值為9.88 μg/kg，按貝塞爾公式計算測量重復性標準。

相對標準偏差RSD 為：

在以6 個樣品的平均值報告測量結(jié)果時，相對標準不確定度按如下公式計算：

此分量已經(jīng)合并了試樣不均勻、環(huán)境條件的波動以及操作的差異等隨機因素的影響。因此，在隨后進行的不確定度分量評定時就不需要再考慮這些隨機因素的影響。

②試樣質(zhì)量的不確定度的確定。天平校準證書說明校準的擴展不確定度為0.05 mg，包含因子k=2，因此其標準不確定度為0.025 mg。試樣質(zhì)量為2 g，其相對標準不確定度應為urel（m）=1.25×10-5。

③定容體積的不確定度的確定。檢定規(guī)程JJG196-1990《常用玻璃量器》規(guī)定，10 mL A 級容量瓶的允許誤差為0.02 mL，假設為三角形分布，其相對不確定度應為：

④恩諾沙星標準溶液的不確定度的確定。恩諾沙星標準品純度為98.5%±1.5%，由于沒有不確定度的其他信息，假設是均勻分布，標準不確定度u（P）的值為：

⑤恩諾沙星標準溶液峰面積和恩諾沙星內(nèi)標峰面積測量引入的不確定度分量的確定。為確定恩諾沙星標準溶液峰面積的重復性標準偏差，重復測量標準品濃度和內(nèi)標質(zhì)量濃度均為20 ng/mL 的恩諾沙星標準品6 次，得到峰面積見表2。

單次測量恩諾沙星峰面積的相對標準偏差按如下公式計算：

表1 6 個試驗樣品的恩諾沙星含量

表2 6 次恩諾沙星標準溶液峰面積

取6 次平均值的相對標準偏差為：

按相同公式計算得到內(nèi)標面積的相對標準偏差：

3）不確定度的合成。

試樣中恩諾沙星X 含量的合成不確定度按下式計算：

取包含因子k=2，擴展不確定度：U（X）=ku（X）=2×0.123=0.25 μg/kg

相對擴展不確定度：Urel（X）=0.25÷9.88×100%=2.5%

2 討 論

目前測量不確定度的評定方法有2 種，A 類方法和B 類方法，A 類方法即測量不確定度的A 類評價，用試驗標準偏差或它的倍數(shù)來表示，只要某個是可以重復測量的，在評價其不確定度時，首先應當考慮重復測量引入的不確定度。本試驗測量6 個平行樣本，以此獲得重復測量引入的不確定度。B 類方法是B 類評定，是用不同于測量不確定度A 類評定的方法對測量不確定度分量進行的評定[7,11]，是不具有統(tǒng)計規(guī)律引入的不確定度分析，即對試驗過程中使用的天平、量具等設備引入的不確定度。在本試驗中，考慮到了稱樣使用的天平、定容使用的容量瓶，根據(jù)檢定證書上的擴展不確定度，計算標準不確定度。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦標準中規(guī)定的條件測定雞肉中恩諾沙星殘留量，參考中國農(nóng)科院建立方法《雞蛋和雞肉中氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺殘留測定操作細則》，本試驗測定6 份樣品取平均值報告結(jié)果，其結(jié)果和擴展不確定度為9.88±0.25 μg/kg，包含因子k=2，相對擴展不確定度為2.5%。

3 結(jié) 論

利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）測定雞肉中恩諾沙星含量時，評價不確定度應引入多次重復測量、天平稱量、標準品配制、定容體積等因素。