清香型白酒發(fā)酵過程中微生物及理化指標(biāo)的變化規(guī)律

賈麗艷 郭晉田 劉 帥 王曉勇 韓 英

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801 3 山西杏花村汾酒廠股份有限公司 山西汾陽032209）

清香型白酒是中國白酒主要的一支， 以高粱為原料， 大曲為發(fā)酵劑， 采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝（圖1），通過“清蒸二次清，地缸固態(tài)發(fā)酵，甑桶蒸餾”的方式生產(chǎn)而得[1]。其發(fā)酵工藝包括兩次酒醅發(fā)酵過程，第1 次是以高粱為原料，添加大曲和水固態(tài)發(fā)酵，稱為大楂發(fā)酵；第2 次是以第1 次發(fā)酵蒸餾后的基質(zhì)為原料，添加大曲，固態(tài)發(fā)酵，稱為二楂發(fā)酵。在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，大楂酒和二楂酒具有明顯差異，如大楂酒醇正，二楂酒酸、酯香濃郁，其原因與發(fā)酵基質(zhì)、微生物菌群結(jié)構(gòu)及發(fā)酵環(huán)境分不開。

清香型白酒發(fā)酵過程是微生物適應(yīng)環(huán)境生長代謝的過程。 發(fā)酵環(huán)境中理化指標(biāo)會對酒醅中微生物的代謝生長產(chǎn)生影響， 微生物的代謝生長又影響微生物的菌群結(jié)果，從而影響白酒的風(fēng)格。為此， 研究清香型白酒發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化及理化指標(biāo)的變化規(guī)律， 對于揭示其釀造機(jī)理具有重要意義。近幾年，對于清香型白酒的研究較多， 主要集中于清香型白酒中微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能性菌株， 風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生對酒體風(fēng)格的影響等方面。 對于清香型白酒酒醅發(fā)酵過程中理化指標(biāo)或環(huán)境因素對清香型白酒的釀造微生物菌群的影響研究還較少。 大部分文獻(xiàn)研究了清香型白酒一次酒醅發(fā)酵的菌群或環(huán)境中某個理化指標(biāo)的變化規(guī)律及對白酒的影響。如李增勝等[2]分析了清香型白酒中包括多種微生物，如酵母菌、乳酸菌、紅曲霉等，沒有對其在酒醅如何發(fā)揮功能，影響白酒風(fēng)味做進(jìn)一步的闡述；曹云剛等[3]、劉堅(jiān)等[4]僅研究了汾酒酒醅發(fā)酵某一階段有機(jī)酸的變化規(guī)律；徐瑾等[5]運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)研究了清香型白酒自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化；雷震河等[6]利用高通量測序技術(shù)研究汾酒發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。

為此， 課題組以釀造清香型白酒的大楂和二楂酒醅為研究對象， 測定不同發(fā)酵階段酒醅中微生物菌群、淀粉、還原性糖含量及理化指標(biāo)，研究大楂和二楂發(fā)酵過程中微生物、 代謝物及理化指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律， 為探明傳統(tǒng)清香型白酒釀造機(jī)理及傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵的可調(diào)控化、機(jī)械化、自動化和智能化的發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

圖1 傳統(tǒng)清香型白酒釀造工藝流程Fig.1 The flowchart on the brewing process of the traditional mild flavour Baijiu

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采樣地點(diǎn)： 某清香型白酒廠實(shí)驗(yàn)分廠。

采樣時間： 2015年5月份-6月份。

樣品及編號： 大楂和二楂分別發(fā)酵0，3，7，10，15，21，23，28 d 的酒醅樣品。 樣品采集使用多點(diǎn)取樣法，即在發(fā)酵缸表面的中央位置分別在上、中、下3 層3 個位點(diǎn)取等量酒醅樣品，混合均勻，備用。

1.2 檢測指標(biāo)及測定方法

1）酸度的測定 采用酸堿滴定法，參考國標(biāo)GB/T 5517-2010。

2）酒度的測定 采用酒精計(jì)法， 參考國標(biāo)GB/T 10345-2007 酒精計(jì)法。

3）淀粉含量的測定 采用近紅外檢測技術(shù)[7]。

4）水分含量的測定 采用恒溫干燥法， 參考國標(biāo)GB4800-84。

5）pH 的測定 取5 g 酒醅， 加入45 mL 蒸餾水勻漿。 取樣品40 mL，攪拌均勻后用pH 計(jì)測定。

6）還原性糖的測定 采用菲林試劑法， 參考國標(biāo)GB/T 5009.41-2003。

7）溫度的測定 采用紐扣溫度計(jì)實(shí)時檢測技術(shù)。

8）微生物的分離及計(jì)數(shù) 采用選擇性培養(yǎng)基對霉菌、酵母、細(xì)菌進(jìn)行分離及計(jì)數(shù)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅發(fā)酵過程中微生物菌群的變化

通過倍比稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)， 酒醅發(fā)酵過程中微生物菌群呈動態(tài)變化，且大楂、二楂菌群動態(tài)變化不同。 大楂發(fā)酵初期（1～3 d），菌數(shù)快速增殖，主要為細(xì)菌、酵母，能檢測出少量霉菌；發(fā)酵3～7d，菌數(shù)相對穩(wěn)定，主要為酵母和細(xì)菌，霉菌已檢查不出，表明酒醅中霉菌沒有生長，且大部分孢子在該環(huán)境下死亡； 發(fā)酵7～10 d， 菌數(shù)逐漸下降；15～28 d 出現(xiàn)細(xì)菌、酵母菌“二次生長”現(xiàn)象，其中細(xì)菌主要為乳酸菌。 二楂發(fā)酵過程中微生物生長趨勢與大楂發(fā)酵過程相似卻又不同， 表現(xiàn)為從二楂發(fā)酵開始分離不到霉菌， 究其原因可能是霉菌及其孢子對酸度敏感，二楂酒醅中pH 值偏低，抑制了孢子的萌發(fā)?？傊?，酵母菌和細(xì)菌是酒釀造過程中最活躍的功能菌群。 不同種屬微生物出現(xiàn)在釀酒過程的不同時段，呈現(xiàn)出菌群“順序消長，依次代謝”的特點(diǎn)。 王薇等[9]研究發(fā)現(xiàn)清香型白酒中酵母結(jié)構(gòu)演替變化， 且大楂和二楂酒醅含有的優(yōu)勢酵母有所區(qū)別， 這可能是造成大楂酒和二楂酒差異的重要原因之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)酒醅發(fā)酵過程中乳酸菌發(fā)生動態(tài)變化， 發(fā)酵起始為乳球菌，發(fā)酵后期為乳桿菌，其原因可能是乳球菌需要的營養(yǎng)條件較乳桿菌低，且對酸、酒精的耐受性較低；乳桿菌的營養(yǎng)要求較高，且對酸、酒精具有一定的耐受性[10]。

2.2 發(fā)酵過程中溫度的變化

由圖2 可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大楂、二楂發(fā)酵溫度逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵7 d 左右時，溫度達(dá)到31℃左右，隨后溫度慢慢降落，15 d 后，溫度緩緩降低到25 ℃以下。 溫度的變化反應(yīng)酒醅發(fā)酵與否。酒醅溫度變化反映酒醅發(fā)酵的正常與否。 清香型白酒大楂和二楂發(fā)酵過程中溫度呈現(xiàn) “前緩、中挺、后緩落”的變化規(guī)律[11]，這是微生物的生長代謝產(chǎn)生生物熱與酒醅發(fā)酵環(huán)境熱能傳遞平衡的結(jié)果。

圖2 酒醅發(fā)酵過程中溫度的變化Fig.2 The temperature changes of the fermented grains in the brewing process

2.3 酒醅發(fā)酵過程中pH 和酸度的變化

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大楂酒醅的pH 值從0 d 時的5.48 變?yōu)?8 d 時的3.36 （圖3）。 其中，1～3 d，pH 值下降較快，從pH 5.5 降到pH 4.6，下降1 個數(shù)量級， 其原因可能是由于在此過程中酵母菌大量生長繁殖，產(chǎn)生大量的CO2，使得酒醅pH 值迅速下降；3～15 d，pH 值變化幅度較前期變小，其原因主要是酒醅中的氧氣已消耗殆盡， 酵母從有氧生長階段進(jìn)入無氧發(fā)酵產(chǎn)酒精階段；15～28 d，隨著pH 值和酒精度的升高，酒精發(fā)酵趨于停止，此時發(fā)酵液中的乳酸菌等厭氧或兼性厭氧菌再生長，產(chǎn)生有機(jī)酸，如乳酸、醋酸等，使pH 值下降。二楂酒醅pH 值的變化趨勢同大楂相似（圖3）。所不同的是二楂發(fā)酵的起始pH 值較低， 為4.2，這可抑制大部分霉菌和細(xì)菌的生長。 由此推測發(fā)酵起始沒有霉菌的生長。 發(fā)酵28 d 時，其pH 值為3.27，這與大楂28 d 的pH 值相近，推測當(dāng)pH3.3時酒醅中產(chǎn)酸微生物的發(fā)酵受到抑制。為此，筆者跟蹤了發(fā)酵30 d 酒醅的pH 值，發(fā)現(xiàn)其pH 值基本不變，表明產(chǎn)酸菌在pH3.3 時生長、繁殖、代謝基本停止。

酒醅發(fā)酵過程中大楂、 二楂的酸度均呈上升趨勢，其中，二楂比大楂產(chǎn)生的酸度高（圖4），這不同于大、二楂的pH 值在發(fā)酵后期幾乎相同（圖3）。 產(chǎn)生這種情況主要原因是pH 值變化反映游離H+量的變化；而酸度變化反映電解和未電解的所有酸的H+。 發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)主要為有機(jī)酸，而大部分有機(jī)酸為弱酸，且不同的有機(jī)酸的電解能力略有差別。 這可能是造成酒醅二楂酸度升高，而pH 值變化不大的原因。 以上結(jié)果表明清香型白酒酒醅具有較強(qiáng)的緩沖能力[11]。

圖3 酒醅發(fā)酵過程中pH 值的變化Fig.3 The pH changes of the fermented grains in the brewing process

圖4 酒醅發(fā)酵過程中酸度的變化Fig.4 The acidity changes of the fermented grains in the brewing process

2.4 酒醅發(fā)酵過程中水分含量的變化

酒醅發(fā)酵過程中水分的來源有兩個方面：一是酒醅發(fā)酵前，外界添加水分；二是酒醅發(fā)酵代謝過程中，生理生化反應(yīng)，消耗和產(chǎn)生的水分。 水的作用是多方面的，包括潤糧，傳遞熱量，保證糧食均一糊化；為酒醅發(fā)酵特供溶劑，使固態(tài)發(fā)酵體系呈現(xiàn)較均質(zhì)的體系；為微生物的發(fā)酵生長、繁殖、代謝提供水分活度。 酒醅發(fā)酵過程中水分含量的多少影響微生物代謝生長及菌群結(jié)構(gòu)， 微生物的代謝生長又影響酒醅發(fā)酵過程中的水分含量。 清香型白酒大、 二楂酒醅發(fā)酵過程中水分變化見圖5。 大、二楂酒醅起始發(fā)酵水分含量不同，大楂為50%，二楂為60%。 隨著發(fā)酵的進(jìn)行，水分整體呈上升趨勢，發(fā)酵23 d 后，水分含量基本保持穩(wěn)定，分別達(dá)63%，70%左右。

2.5 酒醅發(fā)酵過程中淀粉含量的變化

淀粉是酒醅發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生酒精及其它碳水化合物的底物， 它濃度的大小影響發(fā)酵快慢及出酒率的高、低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大、二楂酒醅中淀粉含量均呈遞減的趨勢。大楂發(fā)酵過程中，0～7 d 淀粉含量下降較多，7～17 d 淀粉含量下降變緩，17～21 d 淀粉變化又大，21 d 后淀粉含量變化趨于穩(wěn)定。 二楂發(fā)酵過程中，0～7 d 淀粉含量下降偏少，7～21 d 淀粉含量的變化大，21～23 d 淀粉下降最多，23 d 后淀粉含量保持不變。酒醅發(fā)酵過程是淀粉酶水解淀粉的過程（圖6）。 淀粉酶的來源可能有兩種：一是大曲直接帶入酒醅的淀粉酶，這類酶隨著發(fā)酵溫度及環(huán)境pH 值的降低而降低，在發(fā)酵過程中引起淀粉含量變化變緩； 二是酒醅發(fā)酵過程中微生物此消彼長， 順序生長代謝產(chǎn)生的淀粉酶。 在發(fā)酵過程中這類酶可能引起淀粉含量變化大。 依據(jù)大、 二楂酒醅發(fā)酵淀粉含量變化趨勢， 推測清香型白酒酒醅發(fā)酵過程中淀粉酶的來源應(yīng)包括以上兩種。 清香型白酒的生產(chǎn)，提倡“養(yǎng)大楂，擠二楂”[12]，以保證出酒率和酒的品質(zhì)。 筆者認(rèn)為通過控制酒醅中淀粉的釋放及淀粉的水解程度可達(dá)到以上目的， 這是因?yàn)樵诖箝l(fā)酵過程中過多淀粉的暴露及淀粉的水解導(dǎo)致大楂發(fā)酵后期還原性糖含量較高， 而發(fā)酵后期主要微生物為乳酸菌，還原性糖被乳酸菌快速利用，這將促進(jìn)淀粉的消耗和大楂酒醅酸度的提高， 從而影響二楂的出酒率和質(zhì)量。

圖5 酒醅發(fā)酵過程中水分含量的變化Fig.5 The water content changes of the fermented grains in the brewing process

圖6 酒醅發(fā)酵過程中淀粉含量的變化Fig.6 The starch content changes of the fermented grains in the brewing process

2.6 酒醅發(fā)酵過程中還原性糖含量的變化

酒醅中還原性糖含量動態(tài)變化的過程主要是酶催化底物產(chǎn)還原性糖和還原性糖被微生物消耗、利用的過程。 由圖7 可知，還原性糖含量先升高后降低再升高再降低，至逐漸趨于平緩。造成以上現(xiàn)象的原因是由于糖化酶分解淀粉， 產(chǎn)生的還原糖被酵母利用，促使酵母生長、繁殖、發(fā)酵。發(fā)酵初期（0～3 d），酵母生長、繁殖階段，還原糖的產(chǎn)生大于還原性糖的利用；發(fā)酵3～15 d，酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精階段，還原糖的產(chǎn)生小于還原性糖的利用；發(fā)酵15～21 d，酵母對還原性糖的利用降低，清香型白酒酒醅中還原性糖含量降低， 這表明該階段酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)酒結(jié)束， 還原糖的產(chǎn)生大于還原糖的利用；21 d 后，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅酸度升高，對糖化酶活力具有抑制功能，使還原性糖含量降低。

2.7 酒醅發(fā)酵過程匯總酒精含量的變化

酒醅發(fā)酵過程中酒精含量的變化反映酒醅中釀酒酵母的生長代謝狀況。 由圖8 可知，在0～3 d期間， 酒醅中酒精含量變化不大，3 d 后酒精含量逐漸升高，15 d 左右，酒精含量達(dá)到最高值，之后，酒精含量略有降低（圖8）。 產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因主要是0～3 d 為酵母菌體有氧生長增殖過程；發(fā)酵4～15 d 為酵母無氧酒精發(fā)酵的旺盛期；發(fā)酵15 d 后，由于酵母菌處于低pH 值、高酒度的環(huán)境，酵母菌的生長、繁殖、代謝受到抑制[13]。 在發(fā)酵后期，一些厭氧微生物利用酒精生長或酒精與乙酸發(fā)生酯化反應(yīng)，造成后期酒精含量略微降低。

圖7 酒醅發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.7 The reducing sugar content changes of the fermented grains in the brewing process

3 討論

清香型白酒的發(fā)酵過程是微生物生長代謝繁殖的過程， 也是微生物及其代謝產(chǎn)物作用于發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生酒精及白酒風(fēng)味的過程。 推動酒醅發(fā)酵的微生物及其代謝產(chǎn)物主要來源為大曲。 大曲的質(zhì)量和品質(zhì)對清香型白酒的生產(chǎn)及品質(zhì)具有重要的影響[14]。 考察大曲品質(zhì)的重要指標(biāo)之一為淀粉酶活力及生物學(xué)活性。 通過對酒醅中淀粉及其它理化指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，大楂酒醅中淀粉水解程度，影響酒醅的產(chǎn)酒和品質(zhì)。淀粉水解程度低，影響出酒率；淀粉水解程度高，發(fā)酵后期還原糖含量高，助推乳酸菌生長，消耗淀粉，引起大楂酒醅后期產(chǎn)酸高，從而影響二楂酒醅出酒率和白酒的品質(zhì)。為控制以上現(xiàn)象， 應(yīng)調(diào)節(jié)控制淀粉酶的活力及環(huán)境耐受性。淀粉酶具有一定的糖化酶和液化酶活力，對酒醅中的酸、 酒度、 溫度具有一定的環(huán)境耐受性，同時，淀粉酶的環(huán)境耐受性也不能太高，以防止發(fā)酵后期產(chǎn)生太多的還原性糖，促進(jìn)酒醅變酸，影響出酒率和品質(zhì)。為此，在大曲標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中，應(yīng)根據(jù)酒醅中環(huán)境及理化指標(biāo)的變化規(guī)律，建立大曲淀粉酶活力范圍及其耐受酒醅酒度、 酸度等理化指標(biāo)的范圍。

圖8 酒醅發(fā)酵過程中酒精含量的變化Fig.8 The alcohol content changes of the fermented grains in the brewing process

4 結(jié)論

1）清香型白酒大楂和二楂酒醅發(fā)酵過程中主要的微生物為酵母、細(xì)菌。乳酸菌是酒醅發(fā)酵后期的主要細(xì)菌。

2）大楂和二楂發(fā)酵過程中淀粉含量變化趨勢有所不同， 推測淀粉的水解程度影響酒醅能否正常發(fā)酵以及大楂和二楂的出酒率和白酒的品質(zhì)。 在大楂發(fā)酵過程中，應(yīng)控制淀粉的水解，以防酒醅后期產(chǎn)酸，影響大楂的酒質(zhì)和二楂的出酒率。

3）溫度在酒醅發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)“前緩、中挺、后緩落”的變化趨勢，發(fā)酵最高溫度在7 d 左右；酒度發(fā)酵15 d 左右趨于穩(wěn)定。 pH 值在大楂和二楂酒醅發(fā)酵過程中逐漸降低，pH 3.3 時趨于穩(wěn)定。