富含谷氨酰胺多肽的制備及其體外模擬消化

任嬌艷 林曉玲 岑月妍 尹西拳 梁 明 袁爾東*

（1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510640 2 中新國際聯(lián)合研究機(jī)構(gòu) 廣州510555 3 無限極（中國）有限公司 廣州510665）

氧化應(yīng)激是引起消化道黏膜損傷的重要因素之一。 攝入抗氧化活性物質(zhì)可預(yù)防和治療消化道黏膜疾病。 研究表明，谷氨酰胺（Gln）有助于提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性， 促進(jìn)物質(zhì)抗氧化能力[1]。 此外，它能增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞屏障功能， 增加結(jié)腸和小腸黏膜細(xì)胞合成和防止腸道毒素和細(xì)菌入侵[2]。 然而，Gln 的溶解度低，在水溶液中易水解，且受熱易轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)，因此其應(yīng)用受到極大的限制。 Abumrad N[3]研究證實(shí)，谷氨酰胺肽的酰胺基比游離谷氨酰胺中的酰胺基穩(wěn)定。Bilzer M 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺二肽能夠維持和增加腸黏膜細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成與儲備， 減少氧自由基對腸黏膜的損害。 谷氨酰胺肽不僅保留了谷氨酰胺多種生理功能和營養(yǎng)， 還具有高水溶性、穩(wěn)定性、吸收性和低致敏性等優(yōu)點(diǎn)，可作為谷氨酰胺營養(yǎng)補(bǔ)充的穩(wěn)定化替代品。

目前， 市場上常見的谷氨酰胺肽主要包括人工合成的Gly-Gln 和Ala-Gln。 人工合成法成本高、產(chǎn)量低且生產(chǎn)過程對環(huán)境有污染，使得谷氨酞胺二肽的產(chǎn)品推廣受限[2]。 相反，蛋白酶解法作為天然和高效的多肽制備方法，近年來受到推崇。 乳清蛋白、 大米蛋白和小麥蛋白被報(bào)道具有保護(hù)胃腸道黏膜的功效， 且這幾種蛋白中谷氨酰胺的含量相對較高[5-7]，可作為天然谷氨酰胺肽制備的原料。

在體外模擬消化過程中，環(huán)境pH 的改變和消化酶的作用會影響抗氧化物質(zhì)的降解、 轉(zhuǎn)化和吸收。 相比于大分子質(zhì)量肽，小分子質(zhì)量肽在人體消化中具有更高的抗氧化活性和吸收利用率[8]。研究消化前、 后谷氨酰胺多肽的抗氧化活性變化對判斷其在人體內(nèi)的吸收利用情況， 以及能否發(fā)揮預(yù)防或治療消化道黏膜疾病的功效具有重要的意義。

本研究以3 種谷氨酰胺含量高的蛋白原料（乳清、大米和小麥）為研究對象，通過酶解法制備富含谷氨酰胺的多肽，研究模擬消化前、后對其蛋白質(zhì)含量、酰胺氮含量、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性的影響。 最終篩選出消化利用程度較高的谷氨酰胺多肽的酶解制備工藝參數(shù)和制劑形態(tài)， 為生產(chǎn)具有保護(hù)消化道黏膜功效的功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白粉，廣州比靈天然配料有限公司。4°C 避光保存。 大米蛋白粉，陜西森弗天然制品有限公司。 避光保存于陰涼處。 小麥面筋蛋白粉，北京瑞麥嘉禾商貿(mào)有限公司。 避光保存于陰涼處。

胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶，廣西龐博生物科技有限公司；胃蛋白酶（高純）、胰蛋白酶（高純），上海源葉生物科技有限公司； 水溶性維生素E 標(biāo)準(zhǔn)溶液、熒光素鈉溶液（Fluorescein）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

八孔消化爐、KDN-1 型自動定氮儀， 上海纖檢儀器有限公司； LC-20A 高效液相儀，日本島津公司；Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀， 美國伯騰儀器有限公司；TSKgel-G2000SWXL，日本東曹株式會社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定 采用GB/T 5009.5-2003《凱氏定氮法》測定原料蛋白（乳清、大米和小麥）的總蛋白質(zhì)氮含量以及各多肽的蛋白氮含量，按照公式（1）計(jì)算各多肽的蛋白質(zhì)回收率。

1.3.2 富含谷氨酰胺蛋白肽的制備 乳清、 大米和小麥蛋白按照1∶10（m∶V）的料液比溶解，胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶先于50 ℃下預(yù)熱活化10 min。 酶解過程保持加酶量0.75%，溫度50 ℃。 根據(jù)各酶的最適酶解條件， 調(diào)節(jié)酶解液pH 值分別為8.0，7.0，9.0，6.5 和6.0，酶解4 h 后采用沸水浴滅酶。 將各酶解液8 000 r/min 離心20 min，濃縮、凍干獲得相應(yīng)多肽。

1.3.3 酰胺氮含量的測定 參考陳思思[2]的方法并稍作修改。采用擴(kuò)撒皿法測定酰胺氮含量，具體步驟如下： 配制1%蛋白酶解液于15 mL 水解管中，加入1.5 mL 12 mol/L HCl，1.5 mL H2O，封管后于110 ℃水解3 h。測定時在擴(kuò)撒皿中央加入6 mL 硼酸溶液（2%）和6 滴甲基紅溴甲酚綠混合指示劑， 同時移取2.4 mL 水解液于擴(kuò)散皿外圍，加入6 mL NaOH 溶液（40%）。 迅速蓋好平板輕輕搖勻，充分混合水解液和NaOH。 室溫反應(yīng)2.5 h 后移去平板， 以0.01 mol/L 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定擴(kuò)散皿中央的硼酸溶液至微紅色。按照公式（2）計(jì)算酰胺氮含量。

式中：WN——酰胺氮含量，mmol/g 蛋白；CHCl——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸濃度，mol/L； VHCL——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積，mL；WT——樣品中蛋白含量，g。

1.3.4 肽分子質(zhì)量分布的測定 參照任嬌艷等[9]的方法， 采用凝膠色譜法測定多肽的相對分子質(zhì)量分布。 分離柱為TSK G2000 SWXL （7.8 mm×300 mm），液相系統(tǒng)為島津LC-20A，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長214 nm。 流動相為0.1 mol/L PBS 和0.1 mol/L Na2SO4（pH 6.7），洗脫流速0.5 mL/min。

1.3.5 羥自由基清除活性的測定 羥自由基清除活性的測定參照唐正江[10]的方法并作適當(dāng)修改。具體步驟是：

1）向10 mL 具塞試管中依次加入1.2 mL 鄰二氮菲 （5 mmol/L），0.8 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），1.2 mL 蒸餾水，1.2 mL 15 mmol/L EDTA。 充分搖勻后，加入1.2 mL FeSO4溶液，混勻，加1.6 mL 0.1%H2O2，于37 ℃反應(yīng)1 h。 反應(yīng)結(jié)束后迅速取樣于酶標(biāo)儀中測定波長536 nm 處的吸光度，記為Ap。

2）以1.6 mL 蒸餾水代替本節(jié)1）中1.6 mL 0.1%H2O2，記為Ab。

3）用1.0 mL 1 mg/mL 多肽溶液代替本節(jié)1）中第1 次加入的蒸餾水，記為AS。

按照公式（3）計(jì)算OH·清除率R。

1.3.6 氧自由基吸收能力（ORAC）的測定 參照文獻(xiàn)[11]、[12]方法測定氧自由基吸收能力（ORAC），并作適當(dāng)修改。在96 孔熒光板各微孔中加入20 μL 75 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）、待測多肽（50 μg/mL）及Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.25，12.5，25 μmol/L 和50 μmol/L）， 于37 ℃孵 育10 min后， 用多道移液器迅速在各孔中加入200 μL 0.096 μmol/L 熒光素鈉溶液， 繼續(xù)于37 ℃下孵育20 min， 立即在各孔中加入20 μL 9.95 mol/L 偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）激活反應(yīng)，37 ℃恒溫反應(yīng)。 設(shè)置激發(fā)波長485 nm 和發(fā)射波長538 nm，每隔2 min 測定1 次各孔的熒光強(qiáng)度， 共測定3 h。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)，以體系在抗氧化劑Trolox 作用下的凈熒光衰減面積Net AUC 為縱坐標(biāo)，建立ORAC 值計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)各樣品孵育下體系的熒光衰減面積計(jì)算各多肽的ORAC 值。

1.3.7 優(yōu)選多肽的體外模擬胃腸消化 參考You L 等[13]的方法進(jìn)行體外模擬胃腸消化道酶系的反應(yīng)，并做適當(dāng)調(diào)整。

1）模擬胃消化道酶系 30 mg/mL 多肽溶液用1.0 mol/L HCl 調(diào)節(jié)體系pH 值至2.0。加入胃蛋白酶（E/S=17/1000），適度攪拌，于37 ℃搖床中恒溫孵育90 min 后置沸水浴中滅酶10 min。 將模擬胃消化產(chǎn)物濃縮、凍干，用于各指標(biāo)測定。

2）模擬胃腸消化道酶系 多肽經(jīng)胃消化道酶系消化90 min 后，先用0.9 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至5.3，再用1.0 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.5。 加入胰蛋白酶（E/S=2/125），適度攪拌，于37 ℃搖床中恒溫孵育2 h 后置于沸水浴滅酶10 min。將模擬胃腸消化產(chǎn)物濃縮、凍干，用于各指標(biāo)測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

肽分子質(zhì)量分布測定的高效液相結(jié)果圖由計(jì)算機(jī)采集，使用LC-solution 軟件處理。 每組試驗(yàn)重復(fù)測定3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。 方差分析采用OriginPro8.5（OriginLab 公司）的單因素方差分析（one-way ANOVA），不同字母代表在P ＜0.05 有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件對乳清蛋白肽特性的影響

不同酶解條件下制備的乳清蛋白酶解物的蛋白質(zhì)回收率及酰胺氮含量如圖1a 和1b 所示。 5種乳清蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率無顯著性差異，且均大于70%（P ＞0.05）。 其中，胰蛋白酶組多肽的酰胺氮含量相對較高， 為（0.68±0.12）mmol/g 蛋白，與中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組多肽相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

如圖1c 所示，不同酶解條件下產(chǎn)生的多肽分子質(zhì)量洗脫特性曲線具有很大的差異。 采用面積歸一化法計(jì)算得到不同乳清蛋白肽各分子質(zhì)量區(qū)段占比如圖1d 所示，其中木瓜蛋白酶組多肽分子質(zhì)量大于5 ku 的占比高達(dá)73.23%，顯著高于其余4 種多肽在同一分子質(zhì)量區(qū)段的占比（P ＜0.05），說明其酶解不完全。

如圖1e 和1f 所示， 對各乳清蛋白肽的抗氧化活性進(jìn)行考察，結(jié)果表明：胰蛋白酶組多肽和中性蛋白酶組多肽的羥自由基清除率分別為24.87%和37.65%； 而胰蛋白酶組多肽的ORAC活性顯著高于其余各組（P ＜0.05）， 為2.15 μmol TE/（L·mg）肽。

綜合考慮， 最終選擇ORAC 值較高的乳清蛋白肽（胰蛋白酶組）作為模擬消化的研究對象。

2.2 酶解條件對大米蛋白肽特性的影響

如圖2a 所示，木瓜蛋白酶酶解大米蛋白的蛋白質(zhì)回收率顯著低于其余4 種蛋白酶酶解多肽（P＜0.05）。 根據(jù)圖2a 可知， 木瓜蛋白酶組（0.68 mmol/g 蛋白）和風(fēng)味蛋白酶組的酰胺氮含量（0.64 mmol/g 蛋白）相對較高，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

如圖2c 所示，中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶組多肽的分子質(zhì)量洗脫曲線較平滑，而胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組多肽在小分子質(zhì)量區(qū)段出現(xiàn)尖銳的峰，揭示分子質(zhì)量為1 ku 以下的多肽得到富集。 不同大米蛋白肽各分子質(zhì)量區(qū)段占比如圖2d 所示， 木瓜蛋白酶組的酶解效果最差，其分子質(zhì)量小于1 ku 的肽段占比顯著低于其余各組（P＜0.05）。 由圖2e 和2f 可知，風(fēng)味蛋白酶組多肽的羥自由基清除能力和ORAC 抗氧化活性均優(yōu)于其余各組，其羥自由基清除率為20.70%，ORAC值為1.18 μmol TE/（L·mg）肽。

圖1 酶解條件對乳清蛋白肽蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.1 Influence of hydrolysis conditions on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b）， molecular weight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of whey peptides

綜合上述因素，選擇大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）作為模擬消化的對象。

2.3 酶解條件對小麥蛋白肽特性的影響

如圖3a 和3b 所示， 小麥蛋白木瓜蛋白酶組多肽的蛋白質(zhì)回收率和酰胺氮含量均顯著低于其余各組（P ＜0.05），說明木瓜蛋白酶對含有谷氨酰胺的小麥蛋白的酶解影響顯著。

圖3c 顯示，堿性蛋白酶和中性蛋白酶組多肽均在分子質(zhì)量為5 ku 處的出峰時間后才被洗脫出來，表明這兩種酶對小麥蛋白的酶解完全。結(jié)合圖3d 結(jié)果可知，這兩種酶酶解所得多肽的分子質(zhì)量小于1 ku 的占比均高于80%，且顯著高于其余各組（P ＜0.05）。

各多肽的抗氧化活性如圖3e 和3f 所示。 木瓜蛋白酶組多肽的羥自由基清除能力顯著高于其余各組（P ＜0.05），為26.30%，而其ORAC 抗氧化能力卻顯著低于其余各組（P ＜0.05）。 風(fēng)味蛋白酶組多肽的ORAC 活性相對最高，為1.06 μmol TE/（L·mg）肽。

圖2 酶解條件對大米蛋白肽蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.2 Influence of different hydrolysis conditions on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b），molecular weight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of rice peptides

綜合考慮上述因素，選擇小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）作為模擬消化的對象。

2.4 胃、胃腸模擬消化對富含谷氨酰胺多肽特性的影響

2.4.1 乳清蛋白肽（胰蛋白酶組）根據(jù)圖4a 可知，經(jīng)胃、胃腸模擬消化后，乳清蛋白胰蛋白酶組多肽的蛋白質(zhì)回收率與未消化多肽相比無顯著性差異（P ＞0.05），表明胃、胃腸模擬消化對乳清蛋白肽蛋白質(zhì)含量影響不顯著。

如圖4b 所示，經(jīng)胃消化后多肽酰胺氮含量顯著減少（P ＜0.05），而經(jīng)胃腸消化后，酰胺氮含量增至與未經(jīng)消化的乳清蛋白肽一致的水平， 表明胃腸模擬消化沒有顯著改變?nèi)榍宓鞍纂牡孽０返俊?/p>

由圖4c 可知，經(jīng)胃、胃腸模擬消化后10～12 min 出現(xiàn)的洗脫峰逐漸消失， 表明大分子蛋白組分在消化階段進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成能被人體利用的小肽。 對各消化產(chǎn)物在各分子質(zhì)量區(qū)段的占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4d。 經(jīng)胃腸模擬消化，小分子的寡肽（Mw ＜1 ku）占比顯著增加21.61%（P ＜0.05），說明乳清蛋白肽經(jīng)胃腸道消化后更易被人體吸收和利用。

圖3 酶解條件對小麥蛋白肽蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.3 Influence of hydrolysis conditions on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b）， molecularweight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of wheat peptides

如圖4e 所示，經(jīng)胃模擬消化后，乳清蛋白肽的羥自由基活性無顯著變化（P ＞0.05），而經(jīng)腸消化后，乳清蛋白肽（10 mg/mL）的羥自由基活性顯著降低至19.36%（P ＜0.05）。 結(jié)果表明，酸性條件和胃蛋白酶對乳清蛋白肽發(fā)揮羥自由基清除活性的相關(guān)肽組分無顯著影響。相反，胰蛋白酶作用會進(jìn)一步導(dǎo)致胃模擬消化產(chǎn)物中一些關(guān)鍵活性位點(diǎn)被酶切，從而影響其發(fā)揮作用。 圖4f 顯示，經(jīng)胃、胃腸模擬消化后兩種產(chǎn)物的ORAC 值均顯著降低至1 μmol TE/（L·mg）肽左右（P ＜0.05）。

基于此， 可選擇腸溶膠囊作為富含谷氨酰胺的乳清蛋白肽（胰蛋白酶組）功能性食品的包裝材料。

2.4.2 大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）的蛋白質(zhì)回收率及酰胺氮含量分別見圖5a 和5b。 經(jīng)胃消化和胃腸消化后，蛋白質(zhì)回收率無顯著性差異（P ＞0.05）。 此外，經(jīng)胃腸模擬消化的大米蛋白肽的酰胺氮含量也與未消化組無顯著性差異（P ＞0.05）。

圖4 模擬消化對乳清蛋白肽（胰蛋白酶組）蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.4 Influence of simulated digestion on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b）， molecular weight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of whey peptides （Trypsin group）

根據(jù)圖5c 和5d 可看出，經(jīng)胃、胃腸模擬消化后， 大米蛋白肽及其模擬消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量洗脫特性曲線無明顯變化， 小分子的寡肽 （Mw＜1 ku）占比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

如圖5e 所示，經(jīng)胃模擬消化后，大米蛋白肽（10 mg/mL）羥自由基活性無顯著變化（P ＞0.05），說明低pH 值環(huán)境及胃蛋白酶的酶解不影響該多肽關(guān)鍵氨基酸基團(tuán)與羥自由基作用。 大米蛋白肽經(jīng)胃腸模擬消化后， 羥自由基活性顯著降低（P＜0.05），表明胰蛋白酶的作用使多肽發(fā)揮羥自由基清除能力的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生水解， 從而影響其功效發(fā)揮。

圖5f 顯示， 大米蛋白肽經(jīng)胃模擬消化后ORAC 活性顯著增加（P ＜0.05）。疏水性氨基酸具有較好的ORAC 抗氧化活性[14]，胃蛋白酶對大米蛋白肽的酶解作用可使其疏水性氨基酸暴露在外，有助于提高其ORAC 抗氧化活性。 大米蛋白肽在經(jīng)胃腸模擬消化后，ORAC 活性與未消化的多肽無顯著性差異（P ＞0.05）。

圖5 模擬消化對大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.5 Influence of simulated digestion on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b）， molecular weight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of rice peptides （Flavourzyme group）

可選擇普通膠囊作為富含谷氨酰胺的大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）功能性食品的包裝材料。

2.4.3 小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）的蛋白質(zhì)回收率如圖6a 所示。經(jīng)胃、 胃腸模擬消化后， 其蛋白質(zhì)回收率分別降至52.10%和43.72%。 模擬消化后蛋白含量下降，如圖6b 所示，小麥蛋白肽酰胺氮含量均顯著高于未消化肽的酰胺氮含量（P ＜0.05）。

從圖6c 和6d 可看出，模擬胃腸消化后，分子質(zhì)量洗脫特性曲線沒有發(fā)生明顯變化。 雖然小分子肽（Mw ＜1 ku）占比增至74.59%，但是與未消化組相比無顯著性差異（P ＞0.05）。

如圖6e 所示， 小麥蛋白肽經(jīng)胃腸模擬消化后， 不同濃度消化產(chǎn)物的羥自由基活性與未消化的多肽羥自由基活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。 根據(jù)圖6f 的ORAC 抗氧化活性可知，小麥蛋白肽在模擬消化前、 后ORAC 值均高于0.80 μmol TE/（L·mg）肽，且無顯著性差異（P＞0.05）。 選擇普通膠囊作為富含谷氨酰胺的小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）功能性食品的包裝材料。

2.5 耐受胃腸模擬消化最優(yōu)富含谷氨酰胺酶多肽的篩選

圖6 模擬消化對小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.6 Influence of simulated digestion on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b）， molecular weight chromatogram （c）， molecular weight distribution （d）， hydroxyl radical scavenging activity （e）and ORAC value （f）of wheat peptides （Flavourzyme group）

由圖7a 和7b 可知， 小麥蛋白肽經(jīng)胃腸模擬消化后的蛋白質(zhì)回收率顯著低于乳清蛋白肽和大米蛋白肽（P ＜0.05）。 然而，從酰胺氮含量來看，小麥蛋白肽的酰胺氮含量顯著高于其余兩組 （P ＜0.05）。 小麥蛋白肽在經(jīng)模擬消化后獲得的可被人體吸收利用的肽少， 這些肽中還含有大量谷氨酰胺，其生物利用效率極高。

如圖7c 所示，對小分子肽段（Mw ＜1 ku）占比進(jìn)行考察， 大米蛋白肽和小麥蛋白肽經(jīng)模擬胃腸消化后小分子肽段含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 且均顯著高于乳清蛋白組（P ＜0.05）。 根據(jù)張瑞等[15]、Yang B 等[16]的研究，小分子質(zhì)量肽段往往具有較高的抗氧化活性和生物利用度。 據(jù)此推測這兩組模擬消化產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性。

如圖7e 和7f 所示， 盡管3 種胃腸模擬消化產(chǎn)物的ORAC 活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05），小麥蛋白風(fēng)味蛋白酶肽模擬消化產(chǎn)物的羥自由基清除活性還是顯著高于其余兩組（P ＜0.05），其被人體利用的組分具有更高的活性。

綜合考慮，選擇小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）作為具有保護(hù)胃腸道黏膜功能的最佳功能性食品基料。

圖7 胃腸模擬消化對富含谷氨酰胺的多肽蛋白質(zhì)回收率（a）、酰胺氮含量（b）、分子質(zhì)量圖譜（c）、分子質(zhì)量分布比例 （Mw＜1 ku）（d）、羥自由基清除率（e）和氧自由基清除能力（f）的影響Fig.7 Influence of simulated gastrointestinal digestion on the protein recovery （a）， amide nitrogen content （b），molecular weight distribution （Mw ＜1 ku）（c）， hydroxyl radical scavenging activity （d）and ORAC value （e）of glutamine-rich peptides

3 結(jié)論

1）綜合考慮蛋白質(zhì)回收率、 酰胺氮含量、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性等4 個評價(jià)指標(biāo)， 從3種富含谷氨酰胺的蛋白原料（乳清、大米和小麥）中篩選出乳清蛋白肽（胰蛋白酶組）、大米蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）及小麥蛋白肽（風(fēng)味蛋白酶組）作為模擬消化的研究對象。

2）結(jié)合體外胃、 胃腸模擬消化試驗(yàn)結(jié)果，選定腸溶膠囊作為乳清蛋白肽功能性食品的包裝材料， 以普通膠囊作為大米蛋白肽或小麥蛋白肽功能性食品的包裝材料。

3）體外模擬消化試驗(yàn)結(jié)果表明，相比乳清蛋白肽和大米蛋白肽， 小麥蛋白肽具有相對強(qiáng)的抵抗胃腸道模擬消化的能力，且小分子肽段占比高，更易被人體吸收和利用。 選擇小麥蛋白作為制備富含谷氨酰胺的多肽的原料。其酶解工藝條件為：風(fēng)味蛋白酶0.75%，料液比1∶10，酶解溫度50℃，酶解時間4 h，酶解過程調(diào)節(jié)pH 6.0。