黑蒜多糖的斑馬魚體內抗氧化、抗炎癥活性分析

鄭 嵐 馬耀宏* 孟慶軍 楊俊慧 夏 青 彭 耀 黃金棟 任 鑫

（1 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省科學院生物研究所 山東省生物傳感器重點實驗室 濟南250103 2 萊蕪裕源食品有限公司 山東萊蕪271199）

黑蒜又名發(fā)酵黑蒜，是一種口感軟糯，味道酸甜，具有多種保健功效的新型大蒜發(fā)酵制品[1]。 由于黑蒜具有提高免疫力[2]、抗氧化[3-5]、抗炎癥[6-7]、抗疲勞[8]、調節(jié)血糖和血脂水平[9-11]、保護肝臟[12-14]、抗過敏[15]、潤腸通便[16]等作用，因此，近年來受到消費者的青睞， 成為大蒜深加工領域最受關注的研究熱點[17]。

雖然黑蒜的蒜臭味及辛辣味大大降低， 但是仍有部分消費者不易接受殘留的蒜味。 提取黑蒜中的有效成分，將其加工為黑蒜保健品，成為延長黑蒜產(chǎn)業(yè)鏈的有效途徑之一。高溫、高濕的黑蒜發(fā)酵工藝使大蒜發(fā)生一系列復雜的變化， 多種有益成分含量顯著提高， 其中糖類物質含量升高最為顯著[18-19]。大蒜多糖是大蒜中含量較高的活性成分之一，具有多種生物學活性[20]，對黑蒜多糖的研究正引起人們的重視。 黑蒜多糖是開發(fā)黑蒜保健品的良好材料， 如何有效利用黑蒜多糖的保健價值值得深入研究。 黑蒜多糖的提取方法是黑蒜開發(fā)利用的重要技術問題， 而活性評價是研發(fā)黑蒜多糖保健品的前提和基礎。 本研究采用Plackett-Burman 及響應面試驗設計方法優(yōu)化黑蒜多糖的超聲提取工藝， 采用多種體外試驗分析黑蒜多糖的體外抗氧化能力。 通過建立斑馬魚氧化應激模型和炎癥模型，評價黑蒜多糖的體內抗氧化、抗炎癥能力，為黑蒜多糖保健品的開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獨瓣黑蒜，萊蕪裕源食品有限公司提供；Tg（krt4：NTR-hKitGR）cy17系斑馬魚、AB 系斑馬魚、Tg（Lyz：GFP）系斑馬魚，山東省科學院生物研究所藥物篩選技術重點實驗室提供。

1，1-二苯-2-苦基肼 （DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、甲硝銼，阿拉丁化學試劑公司；三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽），美國Fluka 公司；Pronase E 蛋白酶，索萊寶生物科技有限公司；活性氧（ROS）試劑盒（DCFH-DA），南京建成生物工程研究所；脂多糖，美國Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBST）、4%組織細胞固定液（PFA）、吲哚美辛，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

JY92-Ⅱ超聲波細胞破碎機，上海新芝生物技術研究所；Dynex Spectra MR 酶標儀，美國Dynex Technologies 公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；5804R 離心機， 德國eppendorf公司；LE204E 電子天平， 梅特勒-托利多（Mettler Toledo）公司；UV2700 型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；SZX16 體視顯微鏡， 奧林巴斯（OLYMPUS）有限公司；101A-2 電熱鼓風干燥箱，南通宏大實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑蒜多糖的提取 黑蒜→加水搗碎→超聲波破碎→熱水浸提→離心（10 000 r/min，10 min，4℃）取上清液→按上述步驟重復提取→合并上清液→減壓濃縮→醇沉→離心 （10 000 r/min，10 min，4 ℃）→沉淀于55 ℃烘干→黑蒜多糖。

1.3.2 多糖含量的測定 苯酚-硫酸法測定多糖含量[21]。 標準曲線的繪制：分別取2 mL 不同濃度葡萄糖標準液于試管中， 加入1 mL 6%苯酚和5 mL 濃硫酸溶液， 搖勻后靜置20 min， 于490 nm處測定吸光值，繪制標準曲線并求回歸方程。樣品測定：取2 mL 待測樣品于試管中，加入1 mL 6%苯酚， 以下同標準曲線的測定，3 次重復取平均值，根據(jù)回歸方程計算多糖含量。

1.3.3 黑蒜多糖得率的計算

多糖得率（%）=[多糖質量濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)]/黑蒜質量（mg）×100

1.3.4 黑蒜多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 Plackett-Burman（PB）試驗 以影響黑蒜多糖提取率的因素（固液比、超聲功率、超聲時間、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、乙醇倍數(shù)、醇沉時間）為響應變量（X），以黑蒜多糖提取率為響應值（Y），選取的因素和水平見表1。

利用Design Expert 8.0 軟件設計PB 試驗，選出對黑蒜多糖提取顯著影響的因素。

1.3.4.2 響應面試驗 根據(jù)PB 試驗結果，選擇固液比（x1）、提取時間（x2）、提取次數(shù)（x3）3 個因素為響應變量，以黑蒜多糖的提取率為響應值（Y），響應面試驗的因素和水平表見2。

表1 黑蒜多糖提取PB 試驗因素和水平表Table 1 The factor and level of PB experiment for black garlic polysaccharides extraction

表2 黑蒜多糖提取響應面試驗因素和水平表Table 2 The factor and level of response surface experiment for black garlic polysaccharides extraction

利用Design Expert 8.0 軟件按照Box-Behnken 的中心組合試驗原理設計響應面試驗，分析黑蒜多糖的最優(yōu)提取條件。

1.3.5 體外抗氧化能力的測定

1.3.5.1 羥基自由基清除能力[22]向試管中依次加入1 mL 硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）、1 mL 水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L）、1 mL 多糖樣品溶液和1 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol/L），37 ℃水浴30 min，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃），于波長510 nm 處測定上清液的吸光度A。 維生素C 為陽性對照。

式中，A0——去離子水代替樣品的吸光度。

1.3.5.2 ABTS 自由基清除能力[23]將ABTS 溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（4.9 mmol/L）等體積混合，避光靜置20 h，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，使其在波長734 nm 處吸光度為0.7 ±0.02。 取上述ABTS 工作液0.8 mL 與0.2 mL 樣品溶液混勻，避光6 min，于波長734 nm 處測吸光度A。

式中，蒸餾水代替樣品為空白組（A空），磷酸鹽緩沖液代替ABTS 工作液為對照組（A對）。

1.3.5.3 DPPH 自由基清除能力[24]向試管中加入2 mL 樣品溶液和2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L）， 混合均勻后避光反應30 min， 于波長517 nm 處測定其吸光度A。

式中，A0——2 mL 乙醇與2 mL 樣品混合液的吸光度；A1——2 mL 去離子水與2 mL DPPH 乙醇溶液混合液的吸光度。

1.3.5.4 還原力[25]分別將1 mL樣品溶液、2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 鐵氰化鉀溶液（10 g/L）于試管中混合均勻，置于50 ℃水浴20 min， 加入2 mL 100 g/L 三氯乙酸和1.2 mL 1 g/L 三氯化鐵溶液，混勻后于波長700 nm 處測定吸光度。

1.3.5.5 總抗氧化能力[26]取0.4 mL 樣品于試管中， 加入4 mL P 溶液 （含有0.6 mol/L 硫酸，28 mmol/L 磷酸三鈉，4 mmol/L 鉬酸銨），95 ℃水浴90 min，冷卻后于波長695 nm 處測定其吸光度。

1.3.6 斑馬魚體內活性評價

1.3.6.1 清除自由基 斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield 等[27]的方法。 挑選受精后24 h 健康并帶有綠色熒光的Tg（krt4：NTR-hKitGR）cy17 系斑馬魚胚胎，加入1 mg/mL 蛋白酶脫膜，將脫膜后的斑馬魚移入24 孔板中， 隨機分為5 組， 每孔10條。（NC）正常對照組：養(yǎng)殖水。（MC）氧化應激模型組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）。 （PC）陽性對照組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）和維生素C（25 μg/mL）。 （I，II）高、低劑量黑蒜多糖干預組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）和不同濃度黑蒜多糖 （質量濃度分別為10 μg/mL 和25 μg/mL）。 將裝有斑馬魚的24 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h。 每孔加入100 μL 1 g/mL 三卡因溶液麻醉斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照，用Image pro-plus 軟件計算軀干部熒光點數(shù)。

1.3.6.2 抑制炎癥導致的活性氧簇（ROS）形成將受精后72 h 健康AB 系斑馬魚移入24 孔板中，隨機分為6 組，每孔10 條。 （NC）正常對照組：養(yǎng)殖水。 （MC）炎癥模型組： 養(yǎng)殖水中含有脂多糖（LPS，25 μg/mL）。（PC）陽性對照組：養(yǎng)殖水中含有25 μg/mL 脂多糖和25 μg/mL 維生素C。 （I，II，III）高、中、低劑量黑蒜多糖干預組：養(yǎng)殖水中含有脂多糖（25 μg/mL）和黑蒜多糖（質量濃度分別為25，50，100 μg/mL）。 于28 ℃培養(yǎng)72 h 后， 加入300 μL DCFH-DA 染色40 min，清洗，麻醉斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照。 用Image J 軟件計算熒光強度。

1.3.6.3 抗炎作用 挑選受精后72 h 健康并帶有熒光的Tg（Lyz：GFP）系斑馬魚，隨機移入24 孔板中，分為6 組，每孔10 條。將黑蒜多糖樣品或吲哚美辛與斑馬魚共孵育2 h， 然后用20 μmol/L 硫酸銅處理2 h。用4% PFA 處理斑馬魚1 h，清除PFA并使用PBST 清洗斑馬魚。（NC）正常對照組：養(yǎng)殖水。 （MC）炎癥模型組：硫酸銅處理2 h。 （PC）陽性對照組：5 μg/mL 吲哚美辛處理2 h，然后硫酸銅處理2 h。 （I，II，III）高、中、低劑量黑蒜多糖干預組：黑蒜多糖（質量濃度分別為25，50，100 μg/mL）處理2 h， 然后硫酸銅處理2 h， 在熒光顯微鏡下拍照。 用Image pro-plus 軟件計算中性粒細胞遷移個數(shù)。

1.3.7 統(tǒng)計學方法 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計學分析， 組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異顯著標準。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)化的黑蒜多糖提取工藝

2.1.1 PB 試驗結果

2.1.1.1 PB 試驗設計及結果 苯酚-硫酸法標準曲線的回歸方程為y=0.0088x+0.168，R2=0.9995。PB 試驗設計及結果見表3。

表3 PB 試驗設計及結果Table 3 The design and result of PB experiment

運用Design Expert 8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得多元一次回歸方程：

Y= 1.80 + 0.42X1+ 0.062X2- 0.004983X3+0.084X4- 0.14X5- 0.42X6+ 0.082X7+ 0.080X8，R2=0.9174。

2.1.1.2 PB 試驗的回歸模型方差分析 試驗結果的統(tǒng)計學分析見表4。

表4 PB 試驗的回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for the regression model in PB experiment

由表4 可見， 各因素對黑蒜多糖提取率的影響為：提取次數(shù)＞固液比＞提取時間＞乙醇倍數(shù)＞提取溫度＞超聲功率＞醇沉時間＞超聲時間。其中提取次數(shù)、固液比、提取時間為顯著因素，其它為不顯著因素。 模型顯著（P ＜0.01），失擬值不顯著（P ＞0.05）。 決定系數(shù)R2= 0.9174， 調整性決定系數(shù)R2Adj=0.8348，說明模型在整個回歸區(qū)域中擬合度較好，可準確描述試驗結果。

2.1.2 響應面試驗

2.1.2.1 響應面試驗設計及結果 響應面試驗設計及結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 The design and result of the response surface experiment

運用Design Expert 8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：

Y=3.51+0.011x1-0.16x2-0.084x3+0.13x1x2-0.13x1x3-0.048x2x3-0.44x12-1.04x22-0.84x32，R2=0.9568。

2.1.2.2 響應面試驗的回歸模型方差分析 對響應面試驗的回歸模型進行方差分析， 結果見表6。

表6 響應面試驗的回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for the regression model of response surface experiment

如表6 所示，二次項（x12，x22，x32）對黑蒜多糖提取率顯著影響，而交互項（x1x2，x1x3，x2x3）均不顯著， 說明提取條件間的交互作用較小。 模型顯著（P ＜0.01），失擬值不顯著（P ＞0.05），決定系數(shù)R2= 0.9568，調整性決定系數(shù)R2Adj= 0.9013，說明回歸方程與實際情況擬合程度較好， 模型可很好地反映響應變量（x）與響應值（Y）之間的關系。

2.1.2.3 響應面試驗的響應面圖 用Design Expert 8.0 軟件處理得到的響應面圖（見圖1）。

圖1 不同因素對黑蒜多糖提取率交互影響的響應面圖Fig.1 Response surface plot of interaction of different factors on extraction rate of polysaccharides from black garlic

響應面圖直觀反映因素間相互作用對響應值的影響。如圖1 所示，響應面均為開口向下的凸形曲面，說明響應值（Y）在響應變量（x）所選取的范圍存在最大值。 由響應面模型得出提取黑蒜多糖的最優(yōu)工藝條件：固液比30.09 倍，提取時間1.92 h，提取1.95 次，預測提取率為3.51%。因操作的局限性，故將提取工藝條件修正為：固液比30 倍，提取時間2 h，提取2 次。 在此工藝條件下，黑蒜多糖提取率的實際值為3.65%， 與預測值無顯著差異（P ＜0.01）。 最優(yōu)工藝條件較為可靠，具有實際應用價值。

2.2 黑蒜多糖的體外抗氧化能力

黑蒜多糖的羥基自由基、ABTS 自由基和DPPH 自由基的清除能力以及還原力、總抗氧化能力見圖2。

羥基自由基是一種化學性質活潑且破壞性強的活性氧自由基。DPPH 法和ABTS 法是分析抗氧化物質清除自由基能力最常用的檢測方法。 由圖2a，2b，2c 可見， 黑蒜多糖清除自由基的能力隨濃度的增加而逐漸增強，呈現(xiàn)明顯的量效關系。黑蒜多糖清除羥基自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50值分別為4 322.43，312.15，198.36 mg/L。由圖2d，2e 可見， 黑蒜多糖的還原力和總抗氧化能力呈現(xiàn)明顯的量效關系。 在質量濃度為6 000 mg/L 時， 黑蒜多糖的還原力和總抗氧化能力分別為1.66 和3.35，分別是維生素C 還原力和總抗氧化能力的61.94%和95.99%。

2.3 黑蒜多糖的斑馬魚體內活性評價

圖2 黑蒜多糖的體外抗氧化能力Fig.2 Anti-oxidant activities in vitro of black garlic polysaccharides

2.3.1 清除自由基 Tg （krt4：NTR-hKitGR）cy17系斑馬魚是評價活性物質抗氧化能力的轉基因斑馬魚， 其表皮細胞被構建成為特異性標記熒光蛋白與硝基還原酶的共表達體系，帶有綠色熒光點。當環(huán)境中存在甲硝唑時， 甲硝唑可與表皮細胞中的硝基還原酶結合，產(chǎn)生大量的自由基，引起細胞死亡，綠色熒光點消失。 當抗氧化物質存在時，自由基被及時清除， 從而避免表皮細胞的凋亡和綠色熒光點的消失。 黑蒜多糖清除斑馬魚體內自由基能力的測定結果見圖3、圖4。

圖3 黑蒜多糖清除體內自由基的能力Fig.3 Free radicals scavenging activity in vivo of black garlic polysaccharides

圖4 斑馬魚皮膚細胞的熒光點數(shù)Fig.4 The number of fluorescent spots in zebrafish skin cells

由圖3、圖4 可見，氧化應激模型組（MC）斑馬魚的熒光點數(shù)顯著少于空白對照組（NC）的熒光點數(shù)（P ＜0.01），氧化應激模型構建成功。 與氧化應激模型組相比， 黑蒜多糖干預組的熒光點數(shù)顯著提高（P ＜0.01），黑蒜多糖低劑量干預組（I）和高劑量干預組 （II）的抗氧化率分別為40.18%和50.6%，呈現(xiàn)明顯的量效關系。 維生素C 陽性對照組（PC）的抗氧化率為11.38%。黑蒜多糖通過清除自由基產(chǎn)生較強的抗氧化能力，在25 μg/mL 干預濃度下黑蒜多糖的抗氧化能力高于維生素C。

2.3.2 抑制炎癥導致的活性氧簇（ROS）形成 LPS是革蘭氏陰性細菌特有的物質， 是系統(tǒng)性炎癥反應綜合癥的啟動因子， 可以誘導機體產(chǎn)生炎癥反應，進而導致ROS 含量的升高[28-29]。 黑蒜多糖抑制斑馬魚體內ROS 形成的測定結果見圖5、圖6。

圖5 黑蒜多糖抑制體內ROS 形成的能力Fig.5 Inhibition of ROS formation in vivo by black garlic polysaccharides

圖6 斑馬魚體內ROS 的熒光強度Fig.6 The fluorescence intensity of ROS in zebrafish

斑馬魚體內的ROS 被標記為綠色熒光。 由圖5、圖6 可見，炎癥模型組（MC）斑馬魚的熒光強度顯著高于空白對照組（NC）（P＜0.01），炎癥模型構建成功。 與炎癥模型組相比，黑蒜多糖干預組的熒光強度顯著降低，黑蒜多糖低、中、高劑量干預組（I，II，III）的熒光強度分別降低了11.6%（P＜0.05），35.9%（P＜0.01）和58.2%（P＜0.01）， 陽性對照組（PC）的熒光強度降低了42.5%，說明黑蒜多糖通過抑制斑馬魚體內ROS 形成，減輕氧化應激損傷和炎癥反應。 然而，在25 μg/mL 干預質量濃度下，黑蒜多糖抑制ROS 形成的能力略低于維生素C。

2.3.3 抗炎作用 轉基因Tg（Lyz： GFP）系斑馬魚的中性粒細胞被標記為綠色。 中性粒細胞的激活、遷徙及聚集是炎癥反應的重要特征，可直接反映機體的炎癥水平。 黑蒜多糖抗炎作用的測定結果見圖7、圖8。

圖7 黑蒜多糖的體內抗炎能力Fig.7 Anti-inflammatory ability in vivo of black garlic polysaccharides

圖8 斑馬魚中性粒細胞的遷移個數(shù)Fig.8 The number of migrating neutrophils of zebrafish

由圖7、圖8 可見，炎癥模型組（MC）斑馬魚的中性粒細胞遷移數(shù)顯著高于空白對照組（NC）（P ＜0.01），硫酸銅誘導的炎癥模型構建成功。 與炎癥模型組相比， 黑蒜多糖干預組的中性粒細胞遷移數(shù)顯著減少，黑蒜多糖低、中、高劑量干預組（I，II，III）的細胞遷移數(shù)分別降低了58.33%（P ＜0.01），70.34%（P ＜0.01）和88.35%（P ＜0.01），陽性對照組（PC）的熒光強度降低了73%。 這說明黑蒜多糖具有顯著的抗炎作用， 當其干預質量濃度為100 μg/mL 時，其抗炎效果與抗炎藥物吲哚美辛（5 μg/mL）無顯著差異（P ＞0.05）。 由于黑蒜多糖具有顯著的抑制炎癥導致的ROS 形成能力，所以黑蒜多糖的抗炎機制可能與其阻斷ROS 介導的炎癥反應信號途徑相關。

3 結論

黑蒜多糖最優(yōu)提取工藝為：提取2 次、固液比30 倍、提取時間2 h、乙醇3 倍、提取溫度70 ℃、超聲功率300 W、 醇沉時間16 h、 超聲時間10 min，在該條件下黑蒜多糖的實際提取率達3.65%。 黑蒜多糖具有良好的體外抗氧化能力，清除羥基自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50值分別為4 322.43，312.15 和198.36 mg/L，在黑蒜多糖質量濃度為6 000 mg/L 時， 還原力和總抗氧化能力分別為1.66 和3.35。 通過建立甲硝銼誘導的斑馬魚氧化應激模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖具有顯著的自由基清除能力（P ＜0.01）。 通過建立脂多糖誘導的斑馬魚炎癥模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖可顯著抑制炎癥導致的ROS 含量升高（P ＜0.01）。 通過建立硫酸銅誘導的急性炎癥模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖具有顯著的抗炎活性（P ＜0.01）。 結論：黑蒜多糖具有良好的抗氧化、抗炎癥活性，可用于開發(fā)具有相應功效的保健食品。