針刀干預(yù)對(duì)KOA兔關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué) 及股四頭肌收縮性能的影響*

胡 波，于佳妮，張慧方，劉乃剛，郭長(zhǎng)青

(1.北京水利醫(yī)院，北京 100036； 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120； 3.中日友好醫(yī)院，北京 100029； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是造成慢性疼痛和殘疾的主要疾病之一，是現(xiàn)代社會(huì)一項(xiàng)主要的公共健康問(wèn)題。膝骨關(guān)節(jié)炎患者人數(shù)眾多，且隨著我國(guó)老齡化的不斷加劇，其人數(shù)不斷增加。一項(xiàng)來(lái)自中國(guó)健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查(China Health and Retirement Longitudinal Study, CHARLS)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示[1]，在全國(guó)范圍內(nèi)的17 128例抽檢個(gè)體中(45歲以上，平均年齡59.8歲)，癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率為8.1%，女性(10.3%)多于男性(5.7%)，結(jié)合第6次全國(guó)人口普查數(shù)據(jù)，我國(guó)45歲以上人口約為4.43億，可以推算出我國(guó)癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的病人數(shù)量約為3 590萬(wàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎的防治形勢(shì)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。膝骨關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，而股四頭肌肌力減弱是造成膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的重要因素[2-4]，對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和病情進(jìn)展都有重要的影響。研究顯示[5-6]，正常的肌肉功能在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、應(yīng)力吸收及平衡、本體感覺(jué)和關(guān)節(jié)穩(wěn)定等方面均發(fā)揮重要的作用，從而保護(hù)關(guān)節(jié)、延長(zhǎng)關(guān)節(jié)使用壽命。目前，對(duì)于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，提高膝關(guān)節(jié)相關(guān)肌肉功能是一項(xiàng)重要措施[7]。針刀療法是一種中醫(yī)原創(chuàng)療法，主要作用于肌肉、韌帶等軟組織[8]，研究表明:[9-10]針刀治療后患者疼痛、功能障礙等癥狀明顯減輕，但針刀治療是否能影響股四頭肌肌力尚未有研究。因此，本研究通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨HE染色及Mankin評(píng)分、股四頭肌收縮性能的觀察，探討針刀治療KOA的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)6月齡新西蘭大白兔28只，購(gòu)自北京金牧羊?qū)嶒?yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK京2015-0005]，體質(zhì)量(2.5±0.54)kg，單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，自然光線照射，室溫(22±2)℃，濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)室定期紫外線消毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

固寶牌樹(shù)脂繃帶(珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司，規(guī)格：15 cm×180 cm)；高分子樹(shù)脂繃帶(蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司，規(guī)格：7.5 cm×360 cm)；漢章系列一次性針刀(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.4 mm×40 mm)；中研太和牌一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm)；HANS穴位神經(jīng)刺激儀(北京華為產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司，LH202H型)；分體式包埋機(jī)(德國(guó)萊卡，EG1150)；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)萊卡，RM2245)；自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡(日本奧林巴斯，BX53)；四道生理記錄儀(成都儀器廠，RM-6240)；肌肉張力換能器(成都儀器廠，JH-2204005，50 g)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

肌肉緩沖液(1 000 mL臺(tái)氏液含：NaCl 8.0 g、10% KCl 2.0 mL、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL、5% NaH2PO4·2 H2O 1.3 mL、NaHCO31.0 g、1M CaCl21.8 mL、葡萄糖1.0 g，超純水定容至1 000 mL)；4%多聚甲醛(北京化學(xué)試劑公司)；酒精(北京民生藥業(yè)有限公司)；1%鹽酸(北京華夏藍(lán)籌生物科技有限公司)；二甲苯(北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司)；石蠟(北京化學(xué)試劑公司)；伊紅y(北京伊諾凱科技有限公司)；蘇木素(北京百諾威生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備

采用改良后Videman左后肢伸直位固定制動(dòng)法復(fù)制KOA模型：造模前禁食10～16 h，耳緣靜脈注3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)法進(jìn)行麻醉，麻醉后，仰臥固定于操作臺(tái)上，先用65℃～85℃熱水浸泡樹(shù)脂繃帶使其軟化，然后牽拉兔左后肢使其處于伸直位，以樹(shù)脂繃帶從腹股溝到足趾固定動(dòng)物左下肢(膝關(guān)節(jié)伸直180°，踝關(guān)節(jié)背屈60°)，并在樹(shù)脂繃帶內(nèi)側(cè)墊一層脫脂棉，隨后用醫(yī)用紗布將樹(shù)脂繃帶固定好后，再外裹2層高分子樹(shù)脂繃帶，待定型后外套絲襪以防動(dòng)物撕咬，剪開(kāi)絲襪末端留出足趾觀察血供、腫脹等情況。共制動(dòng)5周，每組隨機(jī)選取1只模型兔處死，取關(guān)節(jié)軟骨做形態(tài)學(xué)觀察，示造模成功后，拆除制動(dòng)材料。

2.2 分組及處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、模型組、針刀組和電針組4組，每組各7只，其中1只用于造模后形態(tài)學(xué)觀察造模是否成功。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》。除正常組外，其余各組動(dòng)物均采用改良后Videman左后肢伸直位固定制動(dòng)法復(fù)制KOA模型。

2.3 干預(yù)措施

正常組：正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)治療。

模型組：造模后正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)治療。

針刀組：拆除制動(dòng)材料1周后，按照針刀四步進(jìn)針規(guī)程操作，2次/周，共治療4周。具體選點(diǎn)及操作：①股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點(diǎn)進(jìn)針點(diǎn)操作：分別松解股內(nèi)、外側(cè)肌肌腱延續(xù)處，針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;②股直肌肌腱止點(diǎn)：針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;③股二頭肌肌腱止點(diǎn)：針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;④條索結(jié)節(jié)點(diǎn)：在膝關(guān)節(jié)周?chē)M(jìn)行循按觸摸，如有明顯的條索和結(jié)節(jié)，則作為治療點(diǎn),針刀刀刃平行于條索結(jié)節(jié)，刀體與皮膚切面垂直刺入，向條索和結(jié)節(jié)的縱軸方向進(jìn)行上下松解3～5針。

電針組：拆除制動(dòng)材料1周后，進(jìn)行電針治療，3次/周，共治療4周。選穴：梁丘、血海、內(nèi)膝眼和外膝眼，均取左側(cè)穴位，梁丘、血海直刺0.8～1.2 cm，內(nèi)膝眼、外膝眼向髕骨方向斜刺0.5～0.8 cm，以HANS穴位神經(jīng)刺激儀分別連接梁丘與血海、內(nèi)膝眼與外膝眼(疏密波，2/100 Hz，3 mA)，留針20 min。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法

2.4.1 軟骨HE染色 治療結(jié)束1周后，采用麻醉過(guò)量法處死動(dòng)物后進(jìn)行取材，打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，切斷膝關(guān)節(jié)周?chē)g帶及其他軟組織，切掉半月板,暴露股骨遠(yuǎn)端軟骨，以咬骨鉗快速取下股骨內(nèi)側(cè)髁1 cm×1 cm的軟骨-骨標(biāo)本，以生理鹽水沖洗組織塊上的血液、黏液及污物等，浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h。將軟骨-骨標(biāo)本放入EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理，脫水、透明、透蠟后進(jìn)行石蠟包埋，切片6 μm，蘇木素-伊紅染色，每組選取4個(gè)樣本對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨情況進(jìn)行光鏡觀察，采用盲法讓評(píng)分人員對(duì)軟骨HE染色光鏡片按照Mankin法[11]進(jìn)行評(píng)分。

2.4.2 股四頭肌收縮力學(xué)檢測(cè) 治療結(jié)束1周后，取材前進(jìn)行股四頭肌收縮力學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)前動(dòng)物禁食12 h，耳緣靜脈注射麻醉(3%戊巴比妥鈉,30 mg/kg)。麻醉后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仰臥固定于兔臺(tái),在髕骨下方剪開(kāi)皮膚，沿肢體縱軸向上剪開(kāi)皮膚直到大腿根部，繼續(xù)向上剪開(kāi)皮膚3～4 cm，小心剝離皮膚、筋膜,暴露肌層。切斷髕韌帶，小心分離股四頭肌至髂骨連接處，保持股四頭肌與髂骨處于連接狀態(tài)。將手術(shù)縫合線結(jié)扎于髕骨與股四頭肌的肌腱連接處，牽拉肌肉到自然狀態(tài)下的長(zhǎng)度后連接于張力換能器，保持肌肉上結(jié)扎線、肌肉走行、張力換能器上的結(jié)扎線在一條直線上。

將張力換能器固定于支架上，將換能器上的信號(hào)采集線連接于MR-6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)處理器。刺激電極平行扎入股四頭肌肌腹，避免電極相互接觸。啟動(dòng)示波按鈕，調(diào)節(jié)張力換能器在支架上的位置使基線維持在-2后歸零。選擇刺激器的刺激參數(shù)，波寬5 ms，延時(shí)10 s，先采用單刺激，刺激強(qiáng)度從零開(kāi)始逐漸微調(diào)遞增，每次增加0.1 v的刺激強(qiáng)度，觀察肌肉收縮曲線變化及收縮幅度，直至找到股四頭肌單收縮的最大收縮幅度(Pt)，并記錄。利用引起肌肉單收縮的最大刺激幅度的60%為基線給予肌肉連續(xù)刺激，逐漸加大刺激幅度，觀察肌肉收縮曲線變化，直到找到股四頭肌強(qiáng)直收縮的最大收縮幅度(Pt)并記錄。在肌肉每次收縮后，都給予肌肉30 s的休息時(shí)間，并不斷滴加肌肉緩沖液。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組兔軟骨HE光鏡觀察結(jié)果比較

正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，由淺入深可見(jiàn)表淺層、移行層、輻射層和鈣化層，四層結(jié)構(gòu)清晰可辨。表淺層軟骨細(xì)胞較小，呈扁平狀，其長(zhǎng)軸與軟骨表面平行，單個(gè)分布;移行層細(xì)胞呈圓形, 大小差別不大, 排列無(wú)規(guī)律，細(xì)胞分裂增生形成同源群;輻射層多個(gè)細(xì)胞呈柱狀排列, 與軟骨表面垂直，細(xì)胞間質(zhì)較多,潮線清晰完整,無(wú)軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，無(wú)血管翳生成。

模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨層次紊亂，四層結(jié)構(gòu)分辨不清，表層和移形層軟骨分層剝脫，部分區(qū)域剝脫至輻射層，表層和移形層軟骨細(xì)胞彌漫性增生，細(xì)胞簇集現(xiàn)象嚴(yán)重(如封三彩圖1中箭頭所指)，潮線消失，放射層可見(jiàn)少量軟骨細(xì)胞呈柱狀排列。

電針組兔軟骨結(jié)構(gòu)尚清晰，軟骨表面不規(guī)則，軟骨細(xì)胞蔟集現(xiàn)象嚴(yán)重(如封三彩圖1中箭頭所指)，但仍可見(jiàn)到輻射層軟骨細(xì)胞柱狀排列，潮線模糊不清，未見(jiàn)血管翳生成。

針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)較清晰，可見(jiàn)表層、移行層、輻射層和鈣化層，軟骨表面欠光滑，軟骨細(xì)胞排列稍紊亂，軟骨表層、移行層局部可見(jiàn)軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象(如封三彩圖1中箭頭所指)，輻射層軟骨細(xì)胞仍呈柱狀排列，排列較規(guī)則，與軟骨表面垂直，細(xì)胞分裂成同源群，潮線較模糊，未見(jiàn)血管翳生成。見(jiàn)封三彩圖1。

3.2 各組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評(píng)分比較

造模組后，模型組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評(píng)分較正常組明顯升高(P<0.01)。電針、針刀干預(yù)后，兩組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.01)，針刀組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評(píng)分較電針組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評(píng)分比較

注：與正常組比較,**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05

3.3 各組兔股四頭肌收縮力學(xué)結(jié)果比較

造模后，模型組兔在股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度上較正常組均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。干預(yù)治療后，電針組兔在股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度上較模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)，針刀組兔在股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度上較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，較電針組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組兔股四頭肌收縮力學(xué)結(jié)果比較

注：與正常組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較,#P<0.05，##P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05

4 討論

KOA是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，性別、體重、內(nèi)分泌代謝及生物力學(xué)等諸多因素都能影響KOA的進(jìn)展，其中生物力學(xué)因素起到至關(guān)重要的作用。正常的膝關(guān)節(jié)活動(dòng)需要骨、韌帶等提供靜力性穩(wěn)定，而肌肉提供動(dòng)力性穩(wěn)定，正常的肌肉功能可維持膝關(guān)節(jié)的良性應(yīng)力分布，從而維持正常膝關(guān)節(jié)軟骨合成分解代謝平衡[12]。在膝骨關(guān)節(jié)炎患者，肌肉功能下降，尤其是股四頭肌肌力下降是引發(fā)膝關(guān)節(jié)應(yīng)力失衡的主要誘因之一，進(jìn)而造成KAO的發(fā)生和加重[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)[15]:膝關(guān)節(jié)周?chē)募∪庵辉诰o張狀態(tài)下加載，對(duì)膝關(guān)節(jié)起到支持作用。也就是說(shuō)，肌肉主動(dòng)收縮功能越強(qiáng)，對(duì)膝關(guān)節(jié)的支持作用越大，膝關(guān)節(jié)越穩(wěn)定。根據(jù)肌骨生物力學(xué)的理論，在正常情況下，骨骼肌的收縮形式包括單收縮和強(qiáng)直收縮兩種方式。肌肉接受支配它的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)發(fā)出的一次刺激后產(chǎn)生的機(jī)械性反應(yīng)，稱單收縮。單收縮是能記錄到的肌肉活動(dòng)的基本單位。當(dāng)給予肌肉刺激的頻率越高時(shí)，肌肉收縮頻率越快，肌肉產(chǎn)生的張力越大。當(dāng)肌肉的收縮融合并維持在最大張力時(shí)，肌肉發(fā)生強(qiáng)直收縮，而強(qiáng)直收縮是骨骼肌能產(chǎn)生流暢運(yùn)動(dòng)的重要機(jī)制，骨骼肌功能主要以強(qiáng)直收縮的方式來(lái)完成。因此，測(cè)定骨骼肌的單收縮和強(qiáng)直收縮最大幅度是分析判斷肌肉的收縮功能的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：造模后，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色顯示軟骨結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，Mankin評(píng)分較正常明顯升高(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度較正常均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明造模后，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變，股四頭肌肌力出現(xiàn)下降。電針、針刀干預(yù)后，電針組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色較模型組有所改善，Mankin評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度較模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)；針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色較模型組改善明顯，Mankin評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度上較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且與電針組相比，Mankin評(píng)分顯著降低(P<0.05),股四頭肌單收縮幅度和強(qiáng)直收縮幅度上顯著升高(P<0.05)。說(shuō)明電針和針刀干預(yù)均可以改善KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨的退變，并改善股四頭肌肌力，且針刀干預(yù)要明顯優(yōu)于電針干預(yù)。

針灸療法是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)療技術(shù)，是治療KOA的有效方法之一[16]，并且已被全世界認(rèn)可和接受，成為多個(gè)國(guó)際KOA臨床指南的推薦療法。針刀療法源于針灸療法，同時(shí)又融合了外科手術(shù)學(xué)的某些技巧，形成了一種獨(dú)具特色的臨床治療方法，在肌肉骨骼系統(tǒng)疾病方面較傳統(tǒng)針灸療法有明顯的優(yōu)勢(shì)[17]。筆者前期的臨床研究[18]顯示電針、針刀治療可以改善患者的膝周軟組織張力，且針刀治療優(yōu)于電針治療。多個(gè)相關(guān)臨床研究[19-21]也有顯示針刀對(duì)于膝骨關(guān)節(jié)炎有較好的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)關(guān)節(jié)軟骨HE染色及Mankin評(píng)分、活體肌肉收縮性能檢測(cè)表明，針刀干預(yù)可以改善模型兔關(guān)節(jié)軟骨的退變，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，同時(shí)可提高股四頭肌的收縮性能，提高股四頭肌肌力，且各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于電針干預(yù),與臨床研究結(jié)果相符。針刀干預(yù)可以提高股四頭肌的收縮性能是其治療KOA的重要機(jī)制之一。