當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝優(yōu)化及其含量測(cè)定

盧森華 劉佳明 張鳳懿

摘要：為優(yōu)化當(dāng)歸藤（Embelia parviflora Wall）中總黃酮提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間為影響因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化當(dāng)歸藤中總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮提取率均有顯著影響，優(yōu)化后的當(dāng)歸藤中總黃酮的最佳提取工藝為50%乙醇溶液料，液比1∶200，提取時(shí)間120 min，蘆丁質(zhì)量濃度在9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為97.6%（n=6），RSD為2.2%。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸藤（Embelia parviflora Wall）;總黃酮;含量;提取工藝

中圖分類號(hào)：TQ461 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）10-0123-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.029 ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To establish the extraction technology and content determination method of total flavonoids in Embelia parviflora Wall. On the basis of single factor experiment， the optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was optimized by L9（34）orthogonal test， and the content of total flavonoids in Embelia parviflora Wall was determined. ? Results showed that the extraction solvent concentration， the ratio of material to liquid， and the extraction time all had significant effects on the extraction rate of total flavonoids from Embelia parviflora Wall. The optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was material-liquid ratio of 1：200， and reflux extraction at 100 ℃ in water bath for 120 min. The linear relationship of rutin concentration was good in the range of 9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）. The average recovery was 97.6%（n=6）， and RSD was 2.2%.

Key words： Embelia parviflora Wall; total flavonoids; content; extracting techonology

當(dāng)歸藤為紫金?？浦参镄』ㄋ崽僮樱‥mbelia parviflora Wall）的根與老莖，別名土當(dāng)歸、篩其蔃等，分布于廣西、云南等地，全年均可采[1]。其味苦、澀，性溫，具有活血、補(bǔ)血、益精壯陽(yáng)、強(qiáng)腰膝的功效，常用于治療血虛諸癥、跌打骨折、腰腿酸痛等病癥[2，3]。當(dāng)歸藤的化學(xué)成分復(fù)雜，目前從當(dāng)歸藤中分離得到的化合物包括黃酮類、萜類、甾體類等[4-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸藤具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血等藥理作用[7，8]。當(dāng)歸藤中黃酮類成分含量較多，目前已有學(xué)者對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮的提取工藝[9]及其含量測(cè)定方法[10]進(jìn)行了初步考察，但總黃酮的提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，測(cè)定方法中對(duì)照品的選擇及顯色方法方面都存在欠缺。因此，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化當(dāng)歸藤中總黃酮的最佳提取工藝， 并測(cè)定其含量，以期為當(dāng)歸藤資源深度開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?藥材與試劑 ?試驗(yàn)所用當(dāng)歸藤樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)陳勇教授鑒定為紫金?？浦参镄』ㄋ崽僮拥母稍锔c老莖。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)0080-9705，中國(guó)藥品生物制品檢定所）;甲醇、無(wú)水乙醇、硝酸鋁[Al（NO3）3]、亞硝酸鈉（NaNO2）、氫氧化鈉（NaOH）均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.1.2 儀器 ?紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（8453型，美國(guó)Agilent公司）;超級(jí)恒溫水浴鍋（501型，金壇市醫(yī)療儀器廠）;電子天平（BP211D型，德國(guó)Sartorius公司）;超聲清洗儀（B35005-MT型，上海必能信公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 ?精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（120 ℃干燥至恒重）5.72 mg，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液適量使溶解，再用50%乙醇溶液定容，搖勻，即得濃度為0.229 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 ?取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液各2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，首先加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置5 min，然后加10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置5 min，再加4% NaOH溶液10 mL，用50%乙醇溶液定容，搖勻，靜置10 min，以50%乙醇溶液為參比。利用UV-Vis法在200～800 nm掃描，結(jié)果在508 nm處蘆丁有最大吸收，故確定508 nm為測(cè)定波長(zhǎng)（圖1、圖2）。

1.2.3 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 ?精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，經(jīng)過(guò)5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液顯色后，利用UV-Vis法在508 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖3。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=12.26x+0.007 7，R2=0.999 8。

1.2.4 ?樣品溶液的制備及總黃酮含量的測(cè)定 ?精密稱定當(dāng)歸藤樣品0.5 g置于250 mL磨口錐形瓶中，按單因素試驗(yàn)中不同的提取條件進(jìn)行提取。精密量取樣品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，經(jīng)過(guò)5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液顯色后，利用UV-Vis法在508 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度，并計(jì)算當(dāng)歸藤中總黃酮的含量。

1.2.5 ?正交試驗(yàn) ?采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮提取率的影響，以確定當(dāng)歸藤中總黃酮的最佳提取工藝。因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方法考察 ?取當(dāng)歸藤樣品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，分別采用靜置、水浴加熱回流、超聲3種方法提取1.0 h后過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL，分別置25 mL量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，使用水浴加熱回流提取方法時(shí)當(dāng)歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.2 ?提取溶劑考察 ?取當(dāng)歸藤樣品2份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入50%乙醇溶液和50%甲醇溶液各50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后濾過(guò)，取續(xù)濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，使用50%乙醇溶液為提取溶劑時(shí)得到當(dāng)歸藤中總黃酮的含量較高。

2.1.3 ?提取次數(shù)考察 ?取50%乙醇溶液提取1次后的當(dāng)歸藤藥渣，再加入50%乙醇溶液50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后濾過(guò)，取續(xù)濾液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，提取1次后，當(dāng)歸藤中總黃酮含量下降較多，考慮到生產(chǎn)工藝對(duì)時(shí)間的要求和溶劑的損耗，提取次數(shù)以1次為宜。

2.1.4 ?提取溶劑體積分?jǐn)?shù)考察 ?取當(dāng)歸藤樣品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入30%、50%、70%、95%乙醇溶液各50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，使用50%乙醇溶液為溶劑體積分?jǐn)?shù)時(shí)得到當(dāng)歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.5 ?提取時(shí)間考察 ?取當(dāng)歸藤樣品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，分別水浴加熱回流提取10、30、60、120 min后過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，提取時(shí)間為60 min時(shí)得到當(dāng)歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.6 料液比考察 取當(dāng)歸藤樣品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，料液比分別為1∶50、?1∶100、1∶200，水浴加熱回流提取1.0 h后過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測(cè)定結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出，料液比為1∶100時(shí)得到當(dāng)歸藤中總黃酮的含量最高。

2.2 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可知，影響當(dāng)歸藤中總黃酮提取率的主次因素為A>B>C，即提取溶劑體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間，3因素中A2>A3>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1。從方差分析結(jié)果（表3）可知，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液料比和提取時(shí)間均有顯著性差異（P<0.05），確定當(dāng)歸藤中總黃酮最佳提取工藝為A2B3C3，即50%乙醇溶液，液料比為1∶200、100 ℃水浴加熱回流提取120 min。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度試驗(yàn) ?精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0 mL，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度平均值為0.58，RSD為0.04%，該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) ?精密稱定同一批當(dāng)歸藤樣品（百色金秀）6份，每份0.5 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，測(cè)定吸光度并計(jì)算當(dāng)歸藤中總黃酮含量。結(jié)果表明，當(dāng)歸藤中總黃酮平均含量為11.77%，RSD為1.0%，該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) ?取供試品溶液1份，在30 min內(nèi)每隔5 min測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，當(dāng)歸藤樣品溶液的吸光度平均值為0.59，RSD為1.2%，該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收試驗(yàn) ?精密稱定已知含量（含量為11.77%）的當(dāng)歸藤樣品（百色金秀）6份，每份0.25 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入蘆丁對(duì)照品29.43 mg，測(cè)定吸光度，并計(jì)算當(dāng)歸藤中總黃酮的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，當(dāng)歸藤中總黃酮的平均回收率為97.6%，RSD為2.2%。

2.4 ?樣品測(cè)定

精密稱定6個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸藤樣品各0.5 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，測(cè)定吸光度并計(jì)算當(dāng)歸藤中總黃酮含量結(jié)果見(jiàn)表5。、

3 ?討論

目前，測(cè)定中藥中總黃酮的含量較常用的方法是比色法（UV-Vis法），主要依據(jù)總黃酮成分特征性的結(jié)構(gòu)具有特定的顯色反應(yīng)，利用適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色，在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)下測(cè)定吸光度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有共同特征的總黃酮成分定量[11，12]。本試驗(yàn)采用UV-Vis法測(cè)定當(dāng)歸藤中總黃酮含量，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均達(dá)到定量分析的方法學(xué)考察的要求，且簡(jiǎn)便易行。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1990版）[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[3] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1979.

[4] 盧森華，張 ?龍，鄭錫任，等.當(dāng)歸藤化學(xué)成分的預(yù)試驗(yàn)研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，14（4）：42-44.

[5] 盧森華，李耀華，陳 ?勇，等.當(dāng)歸藤不同部位揮發(fā)油成分GC-MS分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：733-735.

[6] 盧森華，甘洋縈，陳 ?勇，等.當(dāng)歸藤的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2019，28（24）：53-58.

[7] 魏中璇，劉 ?鼎，陳 ?勇，等.當(dāng)歸藤抗炎、鎮(zhèn)痛及抗凝血有效部位的研究[J].中藥材，2015，38（11）：2376-2380.

[8] 盧森華，陳 ?勇，曾海生，等.當(dāng)歸藤水提物和醇提物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（19）：29-30.

[9] 楊瑞云，管海波，張 ?革，等.當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（4）：217-219.

[10] 盧森華，劉 ?鼎，李怡萱，等. HPLC法測(cè)定當(dāng)歸藤中兒茶素的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（1）：117-119.

[11] 鄭杭生，李 ?計(jì)，韓 ?煒，等.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮含量的方法學(xué)考察要點(diǎn)[J].中成藥，2008，30（9）：1364-1365.

[12] 劉海鷗，虎春艷，普春霞，等.滇黃芩總黃酮不同提取方法的比較分析[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2016， 25（4） ： 21-23.