雞傳染性支氣管炎病毒種子批的建立

汪宏才 汪輝 王紅琳

摘要：為保證傳染性支氣管炎抗原的質(zhì)量，測定了3種不同來源的傳染性支氣管炎病毒株的EID50，選取滴度最高的病毒株作為毒種，建立了傳染性支氣管炎病毒W(wǎng)H株種子批，并對凍干毒種進(jìn)行了毒價測定。結(jié)果表明， 含毒尿囊液在凍干前后毒價無顯著性差異，毒種的EID50在10代內(nèi)無變化。凍干毒種在-40 ℃和-15 ℃保存1年，其毒價基本不變。經(jīng)檢驗種子批未受到細(xì)菌及其他微生物的污染。

關(guān)鍵詞：傳染性支氣管炎;WH株;種子批

中圖分類號：S852.5 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0120-003

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.028 ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： In order to ensure the quality of infectious bronchitis antigen， the EID50 of infectious bronchitis virus strains from three sources were determined and the virus strains with high titer as virus species were selected， and the seed batch of infectious bronchitis virus WH strain were established. The poison value of freeze-dried seed poison was determined. The results showed that there was no significant difference in the poison value of toxic allantoic fluid before and after freeze-drying， and the EID50 of the virus had no change within 10 generations. The poison value of freeze-dried seed poison remained basically unchanged when it was stored at -40 ℃ and -15 ℃ for one year. The seed batch was not contaminated by bacteria and other microorganisms.

Key words： infectious bronchitis; WH strain; seed batch

雞新城疫（Newcastle Disease， ND）和雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis， IB）是影響地方雞的兩種主要病毒性疾病[1]，造成雛雞成活率、成雞產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。為降低ND、IB對中國養(yǎng)禽業(yè)的影響，減少免疫次數(shù)，降低免疫成本，開展雞ND、IB二聯(lián)活疫苗的研制。ND采用耐熱無毒的HB92株，該毒株具有免疫雞能將疫苗毒傳給同群非免疫雞的自然傳播性等特性[2]。禽傳染性支氣管炎病毒W(wǎng)H株是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所自行分離的IBV毒株。進(jìn)化分析表明，該毒株與M41株、H120株以及H52株屬于同一分支，因此也屬于Massachusetts型。為建立雞傳染性支氣管炎WH株種子批系統(tǒng)，按照2015版《中國獸藥典》的相關(guān)規(guī)定，結(jié)合IB最新研究進(jìn)展和方法，對毒種的含量、毒力、安全、效力檢驗與無菌檢驗等進(jìn)行了試驗，為生產(chǎn)合格的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 主要材料 ?IBV毒種1號為凍干毒， EID50為10-7.1/0.1 mL;2號為SPF雞胚尿囊液毒，EID50為 ?10-6.9/0.1 mL;3號為氣管、腎臟混合組織毒，未進(jìn)行EID50的測定。1～3號毒種全部置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。SPF雞胚購于北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。試驗用雛雞是使用SPF種蛋自行孵化，并在禽用隔離器中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 ?檢驗培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司，禽白血病檢測試劑盒購自IDEXX公司。毒種凍干使用美國LABCONCO凍干機，ELISA檢測使用Thermo MK3酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 IBV毒種預(yù)處理 ?1號毒種加入適量無菌PBS溶液進(jìn)行復(fù)原。2號毒種為尿囊液毒種，解凍后直接使用。3號毒種是組織毒，將混合組織剪碎后，置于2 mL無菌EP管中，加入適量PBS溶液進(jìn)行組織搗碎，3 000 r/min離心10 min后取上清，0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.2.2 IBV WH株EID50測定 ?參考文獻(xiàn)[3]，分別將3種經(jīng)過預(yù)處理的毒種，用無菌PBS溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別吸取10-5、10-6、10-7、10-8 4個稀釋度，每個稀釋度分別尿囊腔接種9～11 d SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL置于孵化器中，37 ℃進(jìn)行孵化，記錄其雞胚死亡情況，24 h內(nèi)死亡雞胚不計，144 h內(nèi)死亡的雞胚隨時取出，置于4 ℃保存。至144 h取出所有胚，解剖未死亡雞胚，觀察致侏儒情況，統(tǒng)計后計算EID50，將EID50最大的毒株作為建立種子批的毒種。

1.2.3 IBV WH株種子批凍干 ?將EID50最大毒株用無菌PBS溶液進(jìn)行10-2稀釋，尿囊腔接種9～10日齡SPF雞胚15枚，0.1 mL/胚，棄去24 h內(nèi)死胚，收獲32～36 h SPF雞胚尿囊液，加入適量蔗糖牛奶作為凍干保護(hù)劑，按一定比例混勻后進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.4 凍干品EID50的測定 ?將凍干后的WH株，隨機抽取3瓶，分別加入適量PBS溶液復(fù)原，然后按照“1.2.2”的方法測定EID50。

1.2.5 安全性檢測 ?將凍干品隨機抽取1瓶，用生理鹽水稀釋至105.0EID50。選取1日齡、30日齡、60日齡的健康易感雞各10只， 分別滴鼻1滴（約0.03 mL），檢驗毒株對不同日齡SPF雞的安全性。試驗雞應(yīng)全部健康，無呼吸異常及神經(jīng)癥狀。

1.2.6 特異性檢驗 ?根據(jù)凍干后病毒含量的測定結(jié)果，用生理鹽水稀釋至10-3.5EID50/0.1 mL，與等量抗IBV特異性血清混和均勻，在室溫下作用1 h后，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0.2 mL。置于37 ℃下觀察24～144 h，應(yīng)不引起特異性死亡及雞胚病變，至少有8個以上雞胚健活。

1.2.7 保存期試驗 ?將WH株凍干品隨機抽取若干支，分成兩組，分別置于-40、-15 ℃冰箱保存180、365 d，分別測定其EID50。

1.2.8 毒種純凈性檢驗 ?按《中國獸藥典》[4]2015版附錄的規(guī)定，對種子批進(jìn)行無菌檢驗，結(jié)合分子生物學(xué)方法，進(jìn)行支原體檢驗和外源病毒檢驗[5-7]。

1.2.9 毒種的傳代 ?將WH株凍干毒，用無菌PBS溶液復(fù)原后，按10-2進(jìn)行稀釋后，接種10日齡SPF雞胚3枚，置于37 ℃進(jìn)行孵化，棄去24 h死亡雞胚，收獲36 h尿囊液，置于-80 ℃凍存。按該法進(jìn)行傳代至15代，分別抽取5、10、15代，按“1.2.2”進(jìn)行病毒含量測定，選取病毒含量大于10-7.0EID50/0.1 mL的病毒代次作為最高代次。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV WH株的EID50測定結(jié)果

根據(jù)病毒含量的測定結(jié)果（表1）， 1～3號IBV毒株的EID50分別為10-7.5/0.1 mL、10-7.1/0.1 mL和 ?10-6.9/0.1 mL，1號毒株的病毒含量最高，因此選用1號毒種作為種子批的毒株。

2.2 ?IBV WH株種子批的凍干

將1號毒種接種SPF雞胚后，無菌收獲尿囊液，加入蔗糖牛奶保護(hù)劑后，分裝于西林瓶中進(jìn)行真空干燥，2 mL/瓶，按照2015版《中國獸藥典》附錄中物理性狀檢驗要求，凍干完成后進(jìn)行物理性狀、 真空度、 剩余水分等項目檢測， 結(jié)果符合要求（表2）。

2.3 凍干品病毒含量的測定

凍干后IBV WH株隨機抽檢3瓶進(jìn)行病毒含量的測定，結(jié)果分別為10-7.3EID50/0.1 mL、10-7.5EID50/0.1 mL和10-7.5EID50/0.1 mL，經(jīng)t檢驗，與凍干前病毒含量（10-7.5EID50/0.1 mL）相比，無顯著性差異（P>0.05）。

2.4 凍干品的安全性檢驗

3組試驗組觀察至14 d，全部表現(xiàn)正常，無明顯臨床反應(yīng)，結(jié)果符合要求（表3）。

2.5特異性試驗

觀察至144 h，10枚SPF雞胚未出現(xiàn)死亡。解剖發(fā)現(xiàn)雞胚大小正常，無侏儒胚、無肉眼可見病變。

2.6 保存期試驗

將WH株凍干品分別置于-40 ℃和-15 ℃保存180 d和365 d，其病毒含量無明顯變化（表4）。

2.7 毒種純凈性檢驗

毒種接種TG、TSB培養(yǎng)基，觀察7 d，均無細(xì)菌、無霉菌生長，結(jié)果合格（表5）。接種支原體培養(yǎng)基，移植3代后WH株凍干毒均呈陰性（表6）。新城疫病毒、禽白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織綜合癥病毒檢測結(jié)果也均為陰性（表7）。

2.8 ?毒種傳代情況

IBV WH株凍干毒經(jīng)SPF雞胚傳代后， 測定第5代、第10代和第15代毒種的病毒含量分別為10-7.5EID50/0.1 mL、10-7.3EID50/0.1 mL和10-6.9EID50/0.1 mL（表8），選取大于10-7.0EID50/0.1 mL的代次作為最高代次，因此將毒種傳代次數(shù)限制在10代以內(nèi)。

3 ?結(jié)論

通過對3種雞傳染性支氣管炎病毒株的毒力檢測，篩選出1株滴度高、毒力穩(wěn)定、安全性好的WH株。對凍干種子批進(jìn)行了檢測，各項指標(biāo)符合《中國獸藥典》的要求，可以作為雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗生產(chǎn)的種子批。

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