黃芪與淫羊藿多糖硫酸酯混合物對(duì)小鼠免疫指標(biāo)和血液抗氧化性的影響

張運(yùn)強(qiáng)，周昭彬，張?jiān)坡?，劉自?

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2. 湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

隨著養(yǎng)殖行業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，“防大于治”的管理理念被廣大業(yè)內(nèi)人士所認(rèn)可，在動(dòng)物疾病預(yù)防中，提升免疫功能和抗氧化應(yīng)激又是動(dòng)物抗病的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[1]。中藥是中國(guó)的國(guó)粹，在養(yǎng)殖應(yīng)用上具有悠久的歷史，黃芪和淫羊藿等中藥被證實(shí)對(duì)動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，如史同瑞發(fā)現(xiàn)使用黃芪飼喂仔豬可以顯著提升血液中IgG 和IgA 的含量[2]，而胡月琴發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠中樞免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[3]。但由于國(guó)內(nèi)中藥資源有限，使用中藥原料飼喂動(dòng)物普遍存在著用量大、見(jiàn)效慢、作用時(shí)間長(zhǎng)的劣勢(shì)，中藥添加劑能否充分發(fā)揮效益成為其實(shí)際生產(chǎn)使用的限制因素。

因此，本實(shí)驗(yàn)將淫羊藿多糖進(jìn)行硫酸化后又與黃芪復(fù)方混合，旨在探究該復(fù)方對(duì)動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黃芪和箭葉淫羊藿由湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司提供；酯化修飾劑（氯磺酸與吡啶體積比為1∶8）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。各免疫因子的雙抗體夾心ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；各抗氧化指標(biāo)的比色法測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。周齡為7 周齡、體質(zhì)量為26 g±2 g 的200 只未經(jīng)產(chǎn)的健康成熟雌性昆明小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 中藥混合物的制備淫羊藿多糖硫酸酯（sEPS）由本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[4]制備。將黃芪原料進(jìn)行粉碎并過(guò)40 目篩子（孔徑：0.425 mm），與sEPS 按質(zhì)量9∶1 混合，得試驗(yàn)所用黃芪與sEPS 混合物（以下簡(jiǎn)稱：混合物），將混合物真空包裝后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物分組及處理采用單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)方法，將200 只實(shí)驗(yàn)小鼠，預(yù)飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為4組，每組50 只，分別為對(duì)照組C、處理組T1、T2 和T3，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只；其中對(duì)照組飼喂不含任何飼料添加劑的日糧，T1、T2、T3 分別在基礎(chǔ)日糧上按日糧重量比例添加混合物0.100%、0.175%和0.250%。試驗(yàn)期為28 d，分別在試驗(yàn)開(kāi)始第0、7 d、14 d、21 d、28 d 于各組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2 只實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12 h 后稱重、采血分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。迫殺后無(wú)菌采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺等臟器，用生理鹽水沖洗表面后擦干并稱重。分離十二指腸約2 cm，甲醛固定后室溫保存待測(cè)。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)和器官指數(shù)對(duì)各組小鼠投喂混合物后0、7 d、14 d、21 d 和28 d 的體質(zhì)量和總采食量進(jìn)行稱重，分析小鼠在各個(gè)階段不同處理對(duì)其初重、末重、平均日增重、平均日采食量、料重比變化情況；同時(shí)，檢測(cè)上述各時(shí)間點(diǎn)采集的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺等器官質(zhì)量，計(jì)算器官質(zhì)量與小鼠體質(zhì)量的比值，分析器官指數(shù)變化情況。

1.5 免疫指標(biāo)測(cè)定利用雙抗體夾心ELISA 試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)收集血清中溶菌酶、β 防御素2（HBD-2）、十二指腸SIgA、白細(xì)胞介素（分別為IL-1β、 IL-4、 IL-6 和IL-8）、 腫 瘤 壞 死 因 子α（TNF-α）以及γ干擾素（IFN-γ），利用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用四參數(shù)Logistic 曲線擬合，公式為：

1.6 抗氧化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)利用抗氧化指標(biāo)比色法測(cè)定試劑盒檢測(cè)總抗氧化能力水平（T-AOC）、總過(guò)氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）和過(guò)氧化氫酶（CAT）。利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2016 軟件對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，采用SPSS 22.0 軟件ANOVA 方法進(jìn)行方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，p＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)與器官指數(shù)對(duì)投喂混合物后各個(gè)階段不同處理組小鼠初重、末重、平均日增重、平均日采食量、料重比進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，結(jié)果顯示所述各指標(biāo)數(shù)值均無(wú)顯著變化（p＞0.05）。器官指數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肺臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也均無(wú)顯著變化（p＞0.05）。

2.2 各階段小鼠血清中各免疫指標(biāo)的變化對(duì)各組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)血清中的溶菌酶、HBD-2 和十二指腸SIgA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，（1）溶菌酶：第14 d，T2組顯著高于T3組，且T3組顯著高于C組；第21 d，T2和T3組顯著高于T1和C組（p＜0.05）；（2）HBD-2：第7 d，T2 組和C 組顯著高于T1 組；第21 d，T1、T2 和T3 組均顯著高于C 組（p＜0.05）；（3）十二指腸SIgA：第14 d，T1 和T3 組顯著高于T2 和C 組，第21 d，T1、T2 和T3 組均顯著高于C 組（p＜0.05）（圖1）。由于溶菌酶、HBD-2和十二指腸SIgA均為重要的非特異性免疫指標(biāo)，且根據(jù)結(jié)果分析，C 組的指標(biāo)變化不明顯，而大部分時(shí)間點(diǎn)這3 項(xiàng)指標(biāo)的處理組較C 組有顯著變化，且在21 d變化最明顯，表明混合物能夠影響小鼠的溶菌酶、HBD-2和十二指腸SIgA的水平變化。利用ELISA 方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組各階段的細(xì)胞因子表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示，（1）IL-1β：第14 d 和21 d，C 組顯著高于各處理組；第28 d，C 組顯著高于T1 組（p＜0.05）；（2）IL-4：第7 d 和14 d，T2 和T3組顯著高于T1和C組；第21 d，C組、T2組和T3組顯著高于T1 組（p＜0.05）；（3）IL-6：第7 d，C 組顯著高于T1組，且T1組顯著高于T2和T3組；第14 d，C組顯著高于各處理組；第21 d，C 組顯著高于T1 和T2 組，且T1和T2組顯著高于T3組；第28 d，C組顯著高于各處理組，且T1 組顯著高于T2 組（p＜0.05）；（4）IL-8：第7 d，T2 組顯著高于T1、T3 和C 組；第14 d，C 和T1 組顯著高于T2 和T3 組；第21 d，C、T1 和T2 顯著高于T3組（p＜0.05）；（5）TNF-α：第14 d，C組顯著高于T1和T2組；第21 d，C組顯著高于各處理組，且T1組顯著高于T2和T3組；第28 d，C組和T1組顯著高于T2和T3組（p＜0.05）；（6）IFN-γ：第7 d，T3組顯著高于T1、T2和C組；第21 d，C組顯著高于T2和T3組；第28 d，C組、T1和T2組顯著高于T3組（p＜0.05）（圖2）。

圖1 小鼠飼喂中藥混合物后血清中溶菌酶、HBD-2 和十二指腸SIgA 的變化Fig.1 Changes of lysozyme,HBD-2 and SIgA in serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

圖2 小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ的變化Fig.2 The changes of IL-1 β,IL-4,IL-6,IL-8,TNF-α and IFN-γ in the serum of mice

對(duì)小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，C 組呈不顯著正相關(guān)（p＞0.05）；T1組呈不顯著負(fù)相關(guān)（p＞0.05），T2 和T3 組呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），且T3 組（p=0.011）的顯著性大于T2組（p=0.036）（表1）。血清中IFN-γ和十二指腸SIgA的變化折線圖顯示，C 組變化趨于平穩(wěn)，而T1、T2和T3 組的指標(biāo)變化呈“此消彼長(zhǎng)”的態(tài)勢(shì)（圖3），證明混合物添加日糧能夠增加小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 的雙向調(diào)節(jié)作用，且呈劑量依賴性。

表1 小鼠飼喂中藥混合物后IFN-γ和十二指腸SIgA相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of IFN-γ and duodenal sIgA in mice fed with traditional Chinese medicine mixture

圖3 飼喂中藥混合物后小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 的關(guān)系變化Fig.3 Relationship between IFN-γ and duodenal SIgA in serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

2.3 血清中抗氧化水平的變化利用比色法檢測(cè)飼喂混合物日糧后小鼠血清中的抗氧化指標(biāo)變化，結(jié)果顯示：（1）T-AOC：第7 d，各處理組均顯著高于C 組；第14 d，T1 和T3 組顯著高于C 組；第21 d，T2 和T3 組顯著高于T1 和C 組（p＜0.05）；（2）GSHPX：第21 d，T1 和T2 組顯著高于T3 組（p＜0.05）；（3）CAT：第7 d，T3 組顯著高于C、T1 和T2 組；第14 d，T3 組顯著高于C、T1 和T2 組，且C 和T1 組顯著高于T2 組（p＜0.05）（圖4）。綜上結(jié)果分析，對(duì)于小鼠血清中的總抗氧化水平，除第28 d 因C 組離散度過(guò)高導(dǎo)致顯著性不明顯，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處理組均較C 組有顯著或不顯著提高，小鼠血清中的T-AOC 代表著其總抗氧化水平，因此結(jié)果表明混合物飼喂小鼠能夠改善其抗氧化水平。

圖4 飼喂中藥混合物后小鼠血清中T-AOC、T-SOD、GSH-PX 和CAT 的變化Fig.4 The changes of T-AOC,T-SOD,GSH-PX and CAT in the serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

3 討 論

溶菌酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗菌蛋白。它通常以分解細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖（Peptidoglycan，PG）來(lái)獲得對(duì)細(xì)菌的抵抗。溶菌酶作為一種先天性免疫因子，在動(dòng)物機(jī)體的免疫功能中起著至關(guān)重要的作用[5]。根據(jù)圖1 結(jié)果可知，T2 和T3 組小鼠血清的溶菌酶含量在第14 d 和第21 d 顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。證明混合物飼喂小鼠可在一定劑量和時(shí)間誘導(dǎo)小鼠溶菌酶表達(dá)。其可能的原因是混合物的主要成分黃芪中含有黃芪多糖，湯菊芬等人用黃芪多糖注射液注射羅非魚(yú)，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能誘導(dǎo)羅非魚(yú)肝、脾等組織溶菌酶的表達(dá)，增強(qiáng)羅非魚(yú)的機(jī)體免疫力[6]，溶菌酶具有分解僅由細(xì)菌產(chǎn)生的PG 的能力，因此PG 成為了溶菌酶很好的靶向目標(biāo)[7]。當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體時(shí)，溶菌酶可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8 等促炎因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)殺滅細(xì)菌的功能[8]。Wolf 在研究中發(fā)現(xiàn)，機(jī)體會(huì)通過(guò)細(xì)菌源性脂蛋白和DNA 受體增加炎癥因子IL-6 和TNF-α的釋放[9]。但與上述結(jié)果相反，在本實(shí)驗(yàn)中，T2 組和T3組小鼠的溶菌酶在14 d 和21 d 顯著高于對(duì)照組，但T2 組和T3 組小鼠的IL-6、IL-8 和TNF-α顯著低于對(duì)照組（p＜0.05）或無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。其可能原因?yàn)椋捎谛∈笤囼?yàn)不是病原接種試驗(yàn)，而是讓小鼠在室內(nèi)自然環(huán)境中進(jìn)行的試驗(yàn)，因此該結(jié)果提示：在自然環(huán)境中黃芪和sEPS 混合物飼喂健康小鼠對(duì)其具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能夠誘導(dǎo)溶菌酶的表達(dá)，但不增加IL-6、IL-8 以及TNF-α等促炎因子的釋放。

防御素是富含二硫鍵的陽(yáng)離子多肽，廣泛分布于真菌、植物和動(dòng)物體內(nèi)，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子[10]。HBD-2 廣泛分布于具有直接殺菌作用的動(dòng)物皮膚、黏膜及其他上皮組織中，是一類重要的抗菌肽[11]。雖然HBD-2 是一種重要的非特異性免疫因子，但據(jù)報(bào)道稱，HBD-2 具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，其含量主要受局部炎癥和微生物刺激的調(diào)節(jié)，如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、體內(nèi)共生菌、TNF-α和IL-1β等均可上調(diào)HBD-2 的表達(dá)，繼而導(dǎo)致炎癥區(qū)HBD-2 含量增加[12]。因此，推測(cè)HBD-2與TNF-α、IL-1β等促炎因子的相互作用可能與含量變化效應(yīng)呈正相關(guān)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，T1、T2 組小鼠血清HBD-2 含量在7 d 顯著低于對(duì)照組，21 d各治療組均顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），但TNF-α和IL-1β的檢測(cè)結(jié)果與上述研究結(jié)果不同，第7 d 和21 d時(shí)，兩種細(xì)胞因子水平并不高于對(duì)照組，部分細(xì)胞因子水平甚至呈現(xiàn)出顯著低于對(duì)照組的狀況（p＜0.05）?？梢?jiàn)混合物可在一定時(shí)間和一定程度上增加小鼠血清中HBD-2 的含量，但血清中HBD-2 和TNF-α、IL-1β的表達(dá)特點(diǎn)與局部組織不同。

動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力與抵御疾病、維持健康存在著密切的聯(lián)系，動(dòng)物血清含多種有益于機(jī)體健康的抗氧化因子，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、GSH-PX、維生素C、維生素E 以及β-胡蘿卜素等。它們具有分解自由基、除去起催化作用的金屬離子等作用，當(dāng)機(jī)體的抗氧化能力降低時(shí)，動(dòng)物機(jī)體容易引起免疫力低下、炎癥等問(wèn)題，此時(shí)機(jī)體更容易受到外界病原入侵，動(dòng)物的病死幾率也隨之升高[13]。如圖4 結(jié)果顯示，飼喂高劑量復(fù)合物添加日糧的T3 小鼠血清中總抗氧化水平在7 d、14 d 和21 d 均顯著高于對(duì)照組C 升（p＜0.05），T1、T2 組在某些時(shí)間段也較對(duì)照組有顯著提升，這個(gè)結(jié)果證明，黃芪與sEPS 可在一定程度上提升小鼠血清的抗氧化性。其原因可能是復(fù)合物中含有黃酮類物質(zhì)（如黃芪黃酮）和淫羊藿多糖，黃文靜通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪莖葉提取的總黃酮對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有較高的清除能力，從而實(shí)現(xiàn)抗氧化的功能[14]。但在本實(shí)驗(yàn)中飼喂中藥混合物的小鼠血清中僅CAT 水平在T3 組7 d 和14 d 較對(duì)照組有顯著提升（p＜0.05），而處理組的T-SOD 水平和GSH-PX 活性雖然在大部分時(shí)間節(jié)點(diǎn)上高于對(duì)照組，但差異不顯著（p＞0.05），其原因可能為，動(dòng)物機(jī)體的抗氧化酶僅起到一定的抗氧化效果，而總體抗氧化水平是各抗氧化因子與清除氧自由基共同作用的結(jié)果[15]，因此推測(cè)，混合物雖然對(duì)一些酶的水平和活性提升不顯著，但可以顯著提升綜合抗氧化水平。

免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)于動(dòng)物的抗病能力具有重要意義，但很少有關(guān)于健康動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)能力的評(píng)價(jià)與報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以小鼠IFN-γ和十二指腸SIgA 的變化指標(biāo)進(jìn)行分析，探究了這兩種免疫指標(biāo)的變化關(guān)系和調(diào)節(jié)特點(diǎn)。IFN-γ是Ⅱ型干擾素，主要由活化的NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生，最近的研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在接觸抗原的早期快速而短暫地分泌IFN-γ，這些早期產(chǎn)生的IFN-γ可以通過(guò)抑制初始T細(xì)胞的凋亡來(lái)阻止過(guò)度免疫反應(yīng)的啟動(dòng)[16]。在本實(shí)驗(yàn)中IFN-γ和十二指腸SIgA 的水平呈“此消彼長(zhǎng)”的趨勢(shì)。由于本研究中的小鼠暴露于抗原中，并沒(méi)有在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)，可以推斷，隨著SIgA 含量的增加，對(duì)黏膜的保護(hù)作用增強(qiáng)，小鼠體內(nèi)抗原含量降低，IFN-γ的分泌將啟動(dòng)相應(yīng)的機(jī)制，導(dǎo)致IFN-γ含量下降到一定水平。本研究中隨著混合物的劑量提升，兩種免疫指標(biāo)的負(fù)相關(guān)性也逐步提升，證明了黃芪與sEPS 混合物飼喂小鼠能夠增強(qiáng)IFN-γ和十二指腸SIgA 的雙向調(diào)節(jié)能力，且劑量越高其調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了中藥對(duì)動(dòng)物免疫的雙向調(diào)節(jié)作用[17]，為健康動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。