水貂阿留申病在不同感染率貂場的聯(lián)合檢疫方法

韋 韜，吳艷虹，馬瑞芳，叢 麗，岳志剛，趙永強(qiáng)，肖家美，邵西群

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112）

水貂阿留申?。ˋleutian disease，AD）是由AD 病毒（AMDV）感染引起的慢性消耗性疾病，是水貂養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病[1]。在我國水貂養(yǎng)殖場阿留申病感染率普遍偏高，危害嚴(yán)重[2]。目前無有效疫苗來防控AD[3-4]，主要通過檢疫來凈化感染貂群。碘凝集反應(yīng)（Iodine agglutination test，IAT）最先用于AD 的檢測，雖然是一種非特異性的檢測方法，但可通過碘試劑檢測的凈化血清γ-球蛋白血癥，間接判斷出水貂是否患阿留申病[5-6]。Cho 和Greenfield 采用對流免疫電泳（Counter immuno-electrophoresis，CIEP）即利用阿留申病毒抗原檢測水貂血清中的抗體，間接檢測病毒感染，成功用于阿留申病毒感染貂群的凈化[7]，CIEP 作為檢疫阿留申病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法目前被廣泛使用[8]。然而單純抗體檢疫對感染初期未產(chǎn)生抗體的水貂容易漏檢。PCR 可直接通過檢測外周血的病毒核酸來判斷病毒感染情況以及病毒基因型，常被用于AMDV 的核酸檢測[9-11]。熒光定量PCR（qPCR）方法可定量檢測水貂感染的病毒量，彌補(bǔ)了通過抗體檢測病毒感染的局限[12-14]。AMDV 及其抗體在水貂體內(nèi)呈動態(tài)變化，AD 的單一檢疫方法只適用于病毒感染的某個階段。研究顯示水貂體內(nèi)阿留申抗體存在陽轉(zhuǎn)陰的現(xiàn)象，貂群中還存在AMDV 抗性貂[9,15-16]。為此，本研究對兩個不同感染率貂場開展聯(lián)合檢疫判斷水貂AD 的感染狀態(tài)，旨在為貂場水貂留種和AD 檢疫提出新思路。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理2017 年12 月～2018 年1月，對遼寧省遼中縣A、B 兩個養(yǎng)殖場貂群進(jìn)行檢疫。A 場已連續(xù)開展3 年以上CIEP 檢疫淘汰的防控措施，2017 年12 月該場突然暴發(fā)AD，對A 場2 442只水貂采集血樣，其中公貂110 只，母貂2 332 只。B 場為AD 未檢疫貂場，經(jīng)過初檢為高感染率貂場，共對B 場1 851 只水貂采集血樣，其中公貂262 只，母貂1 589 只。兩場留種公貂與母貂的比例為1∶3～1∶5。留種公貂主要為當(dāng)年貂，母貂為已產(chǎn)仔貂和當(dāng)年母貂，其中已產(chǎn)仔貂＞60%。

采血操作：水貂逐一編號，每只剪取后肢一個趾尖采血約0.5 mL，自然沉降析出血清后，取上層血清100 μL 用于IAT、CIEP 檢測。

1.2 主要試劑Ex Taq DNA 聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 購自寶生物（大連）有限公司；TransStart Tip Green qPCR superMix 試劑盒購自全式金（北京）生物技術(shù)有限公司；AMDV-G 株及其CIEP 抗原、AMDV 標(biāo)準(zhǔn)抗原和陰、陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所提供；分析純KI2和I2購自Sigma 公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成參考文獻(xiàn)[10,17]合成PCR引物AV7-F：5'-ccaacaagtaatgacaccttggt-3'/AV7-R：5'-cctgctggtattatccattcagga-3'，引物擴(kuò)增的預(yù)期長度為786 bp；qPCR 引物YGF：5'-ctgtaacagaaaccaaccaagg ta-3'/YGR：5'-gttggtttggttgctctcca-3'，引物擴(kuò)增的預(yù)期長度為166 bp，均由Thermo Fisher（北京）DNA 合成部合成。

1.4 AD 的CIEP、IAT 檢測參照《水貂阿留申病對流免疫電泳操作規(guī)程SN/T 1314-2003》[8]，對所有水貂血清樣品進(jìn)行CIEP 檢測。在陰、陽性對照成立時，按規(guī)程判定結(jié)果。每個樣品檢測2 次，若第1次與第2 次不一致，則補(bǔ)測1 次。

參考文獻(xiàn)[9]配置試劑對所有水貂血清樣品進(jìn)行IAT 檢測。取10 μL 水貂血清與等量配置的碘試劑混勻，1～2 min 出現(xiàn)沉淀則判定為IAT 陽性。

1.5 AD 的PCR 檢測隨機(jī)選取兩場各200 份血清樣品，提取血清樣品中的病毒DNA，利用AV7-F/AV7-R 引物對樣品DNA 進(jìn)行PCR 檢測。設(shè)置純水為陰性對照，AMDV G 株DNA 為陽性對照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化回收后由長春庫美公司測序。

1.6 AD 感染狀態(tài)判定根據(jù)IAT 結(jié)果判斷水貂是否為高γ-球蛋白血癥（指示慢性感染病癥），根據(jù)CIEP 結(jié)果判斷水貂是否有AMDV 抗體（指示其是否曾感染AMDV）以及PCR 結(jié)果判定水貂是否為AMDV陽性，3 種檢測結(jié)果可將貂群分為6 個類型，即初步定性健康貂為IAT-CIEP-PCR-、AMDV 抗性貂為IAT-CIEP+PCR-、感染AMDV 初期貂為IAT-CIEPPCR+、AMDV 耐受貂為IAT-CIEP+PCR+、AMDV 感染發(fā)病貂為IAT+CIEP+PCR+以及其它慢性病貂。

1.7 AD 的qPCR 檢測每場隨機(jī)選取10 份PCR 檢測為陰性和50 份PCR 檢測為陽性的水貂血清樣品經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室建立的SYBR Green I qPCR 方法檢測病毒載量[17]。qPCR 反 應(yīng) 條 件： 95 ℃3 min；95 ℃15 s、55 ℃10 s、72 ℃10 s，共40 個循環(huán)。設(shè)置純水為陰性對照，AMDV-G 株為陽性對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)反應(yīng)。

1.8 數(shù)據(jù)分析根據(jù)3 種聯(lián)合檢疫方法對這兩個貂場貂群存在不同感染狀態(tài)分類、并計算不同感染狀態(tài)在貂群中的比例。利用GrapahPad Prism 5.3 統(tǒng)計軟件分析兩個貂場主要感染狀態(tài)的差異，用卡方檢驗(yàn)或Student’s T 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，p＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AD 的CIEP、IAT 檢測結(jié)果將貂群AD 感染狀態(tài)分為：IAT-CIEP-、IAT-CIEP+、IAT+CIEP-和IAT+CIEP+。兩個養(yǎng)殖場AD 的CIEP、IAT 檢測結(jié)果顯示，低感染率A 貂場主要為IAT-CIEP-群體，占貂群72%（1764/2442），其次為IAT+CIEP+群體，占貂群16%（399/2442）；高感染率B 貂場主要為IAT+CIEP+群體，占貂群58%（1088/1851），其次為IAT-CIEP+群體，占貂群41%（750/1851）?？梢姴煌珹MDV 感染率的貂場，4 個群體分布不同（表1、表2）。A 與B屬于不同感染率貂場，水貂感染AMDV 后呈現(xiàn)出4種不同的感染狀態(tài)。利用GrapahPad Prism 5.3 軟件的卡方檢驗(yàn)分析A 場IAT-CIEP+群體（119 只）和B 場IAT-CIEP+群體（750 只）的分布差異，結(jié)果顯示x2值為826.44，p＜0.001（x2臨界值10.83，p=0.001），B 場與A 場IAT-CIEP+貂比例差異極顯著?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明在高感染率B 貂場中更易出現(xiàn)IAT-CIEP+類型的感染水貂。利用Student’s T 檢驗(yàn)分析A 場與B 場公貂與母貂感染率（CIEP+）差異。經(jīng)計算結(jié)果顯示，A 場t=5.666，自由度df=4，p 值為0.0048 小于0.01，表明A 場母貂感染率顯著高于公貂，而B 場t=0.8944，自由度df=4，p 值為0.4216 大于0.05，表明該場公貂與母貂感染率差異不顯著。

表1 A 貂場IAT 和CIEP 聯(lián)合檢測結(jié)果Table 1 The combined detection result by IAT and CIEP in A farm

表2 B 貂場IAT 和CIEP 聯(lián)合檢測結(jié)果Table 2 The combined detection result by IAT and CIEP in B farm

2.2 AD 的PCR 檢測結(jié)果隨機(jī)選取A、B 兩個貂場各200 份血清樣品進(jìn)行PCR檢測。綜合2.1及本結(jié)果分析顯示，A 貂場主要為健康貂群（IAT-CIEP-PCR-：44%，88/200），其次為AMDV 感染病貂（IAT+CIEP+PCR+：18%，36/200）以及其它病貂群（30%，60/200），貂群中存在AMDV 感染初期貂（IAT-CIEP-PCR+：8%，16/200）；B貂場主要為AMDV感染病貂（45.5%，91/200），存在一定比例的AMDV 耐受貂（IAT-CIEP+PCR+：35%，70/200）以及AMDV 抗性貂（IAT-CIEP+PCR-：9.5 %，19/200），未發(fā)現(xiàn)AMDV 感染初期貂（圖1）。結(jié)果表明，A 貂場AMDV 耐受貂和抗性貂比例低，貂群中存在感染初期貂，貂場處于AMDV感染初期；B 貂場水貂與AMDV 長期共存，貂群整體抗病力較A 場強(qiáng)，AMDV 耐受貂和抗性貂比例較高，其它患病水貂數(shù)量也較A 場少。

圖1 A、B 兩個貂場IAT、CEIP 和PCR 的聯(lián)合檢測結(jié)果Fig.1 The combined detection results of A and B farms with IAT,CIEP,and PCR

2.3 AD 的qPCR 檢測結(jié)果對A、B 兩個場分別隨機(jī)選取10 份PCR 陰性樣品和50 份PCR 陽性樣品，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的SYBR Green I qPCR[17]進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示，A 貂場qPCR 陽性樣品52 份，陰性樣品8 份，B 貂場qPCR 陽性樣品58 份，陰性樣品2 份。A、B 兩場AMDV 載量最高分別為4.2×106拷貝/μL 和3.1×104拷貝/μL，最低分別為6.1×102拷貝/μL 和8.0×102拷 貝/μL，平 均 分 別 為1.8×105拷 貝/μL 和4.1×103拷貝/μL。A 場水貂體內(nèi)病毒載量離散，但主要分布在1.1×104拷貝/μL～7.5×105拷貝/μL范圍內(nèi)，B場病毒載量集中分布在1.8×103拷貝/μL～9.5×103拷貝/μL范圍內(nèi)。用Student’s T 檢驗(yàn)比較分析A 場（52 只）和B 場（58 只）qPCR 陽性水貂血清病毒載量，計算t=3.008，自由度df=108，p 值為0.0033 小于0.01，兩場水貂血清病毒載量差異極顯著，A 場較B 場陽性水貂體內(nèi)病毒拷貝數(shù)顯著增加（p＜0.01）（圖2）。表明A 場AMDV陽性水貂體內(nèi)病毒復(fù)制能力強(qiáng)且復(fù)制活躍。

圖2 A、B 兩個貂場水貂感染AMDV 載量的檢測結(jié)果Fig.2 The quantitative detection results of AMDV in A and B farms

3 討 論

本研究通過IAT、CIEP 和PCR 聯(lián)合檢測水貂AD感染狀態(tài)，并將貂群分為健康貂（IAT-CIEP-PCR-）、AMDV 感染初期貂（IAT-CIEP-PCR+）、AMDV 耐受貂（IAT-CIEP+PCR+）、AMDV 抗性貂（IAT-CIEP+PCR-）、AMDV 感染貂（IAT+CIEP+PCR+）以及其它慢性病貂。研究表明，水貂感染AMDV 后的發(fā)展?fàn)顟B(tài)與其自身免疫力和AMDV 毒力相關(guān)，主要發(fā)展為3 種類型[9]：病毒持續(xù)感染水貂，造成γ-球蛋白顯著增高，表現(xiàn)出典型AD 癥狀的水貂，判定為阿留申病貂；水貂曾感染AMDV，抗體呈陽性，出現(xiàn)短暫病毒血癥后病毒從外周血中消失，血清中γ-球蛋白含量正常，生產(chǎn)性能無明顯影響，且在不利環(huán)境下仍不表現(xiàn)出AD 癥狀的水貂，判定為AMDV 抗性貂[5,16]；水貂感染AMDV，抗體呈陽性，外周血中病毒載量低，血清中γ-球蛋白含量正常，對生產(chǎn)性能影響較低，無典型AD 癥狀的水貂，判定為AMDV 耐受貂[17]。這與本研究的聯(lián)合檢疫結(jié)果所判定水貂感染AMDV 狀態(tài)相符合。

聯(lián)合檢疫結(jié)果顯示，A、B 兩場水貂AD 感染狀態(tài)分布存在明顯差異。A 屬于低感染率貂場，主要集中為健康貂群（IAT-CIEP-），其它貂群分布較少。CIEP 與IAT 陽性率均約為20%，二者檢測結(jié)果符合率約為88%（2 163/2442），這與之前的研究結(jié)果相一致[18]。該場當(dāng)年公貂感染率顯著低于母貂（p＜0.01），這主要是由于母貂中經(jīng)產(chǎn)母貂約占60%以上，比當(dāng)年貂積累了更多AMDV 感染的數(shù)量。PCR 檢測結(jié)果顯示，IAT-CIEP-貂群中存在感染初期貂（IAT-CIEPPCR+），這對于貂場是潛在感染源。qPCR 結(jié)果表明，與B 場相比A 場貂的AMDV 載量更加離散，病毒載量在6.1×102拷貝/μL～4.2×106拷貝/μL，且病毒載量顯著高于B 場（p＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明A 場屬于早期感染貂場，AMDV 在貂體內(nèi)的復(fù)制處于活躍期。

B 屬于AMDV 高感染率貂場，該場中病毒長期與水貂共存，水貂普遍AMDV 抗體陽性，CEIP 與IAT 檢測結(jié)果符合率為58%（1081/1851），表明長期未檢疫貂場不宜單獨(dú)僅用CIEP 檢疫。與A 場顯著不同，B 場潛在抗性貂和耐受貂群體（IAT-CIEP+）約占41%（750/1851），顯著高于A 場（p＜0.001），顯示長期高感染率貂場更易出現(xiàn)AMDV 抗性貂和耐受貂，這一點(diǎn)與Farid[15]和Kowalczyk 等[19]的結(jié)果相一致。并且當(dāng)年公貂感染率與母貂感染率相近（p＞0.05），展示出B 場AMDV 感染已達(dá)飽和狀態(tài)。qPCR 結(jié)果顯示B 貂場處于低病毒載量感染狀態(tài)，AMDV 載量較為聚集，主要集中在103拷貝/μL 水平，表明B 場AMDV 在水貂體內(nèi)的復(fù)制趨于穩(wěn)定。A 和B 貂場AD 感染狀態(tài)分布顯示出貂群AMDV 感染從初期低感染經(jīng)歷累積后發(fā)展到高飽和感染的過程。

研究結(jié)果表明，不同AD 防控的貂場應(yīng)采取不同淘汰留種策略。多數(shù)學(xué)者建議對于已開展CIEP 凈化的貂場，應(yīng)注意防范檢疫采血過程中的病毒交叉感染，加強(qiáng)貂場污染環(huán)境的病毒消殺，以有效防控水貂AMDV 感染擴(kuò)散[9,20]。但僅用CIEP 檢疫存在一定缺陷，通過連續(xù)清除CIEP+水貂，會降低水貂抵抗力，使水貂對AMDV 更加敏感。Farid 等人指出在外來AMDV 侵入時，CIEP-貂群更易暴發(fā)感染，而耐受貂和抗性貂受到的影響則較低[15]；并且單一CEIP抗體檢疫會造成AMDV 感染初期貂的漏檢，給貂群遺留危險感染源，造成日后AD 的暴發(fā)。因此，AMDV 長期感染但未檢疫的貂場，建議采用聯(lián)合檢疫將IAT-CIEP+PCR-貂群與母貂產(chǎn)仔性能相結(jié)合，保留高產(chǎn)仔成活數(shù)（＞4 只/窩）的母貂，可避免淘汰感染后的康復(fù)貂，降低撲殺損失。AMDV 抗性貂和耐受貂的篩選留種是目前國內(nèi)外防控AD 的策略之一[9,15-16]，該方式有利于提高貂群體對AMDV 感染的整體抵抗力，對高感染率貂場生產(chǎn)有著重要的經(jīng)濟(jì)價值。水貂體內(nèi)AMDV 感染狀態(tài)屬于動態(tài)過程，需通過間隔多次聯(lián)合檢疫，才可檢出狀態(tài)穩(wěn)定的AMDV 耐受貂（IAT-CIEP+PCR+）和AMDV 抗性貂（IATCIEP+PCR-），另外可結(jié)合母貂的產(chǎn)仔性能來篩選有留種價值的AMDV 抗性貂和耐受貂。

綜上所述，聯(lián)合檢疫方法能夠彌補(bǔ)單一抗體或病毒檢疫方法的局限，通過聯(lián)合檢疫結(jié)果可準(zhǔn)確判斷AMDV 感染貂的感染狀態(tài)，并可發(fā)現(xiàn)高感染貂場存在的較高比例的AMDV 耐受貂和抗性貂。建議不同感染率貂場應(yīng)根據(jù)水貂AMDV 感染狀態(tài)，采用適宜的檢疫淘汰策略。本研究通過聯(lián)合檢疫方法為貂場檢疫和淘汰AD 病貂提供了技術(shù)手段。