溫敏型脂質(zhì)納米粒的制備及其識別微波消融邊界效果

周 黎，鄭元義，王志剛，徐金順

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200233；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，四川 成都 610041)

微波消融為局部熱消融技術(shù)之一，能在相對較短時(shí)間內(nèi)使組織溫度升高而發(fā)生凝固變性壞死，最終滅活腫瘤細(xì)胞或根除腫瘤。經(jīng)皮微波消融是安全、微創(chuàng)、療效確切的非手術(shù)治療腫瘤方法[1-2]，但消融過程中腫瘤組織形成的氣化區(qū)易引起消融漏空，導(dǎo)致腫瘤殘留，且可能對毗鄰正常組織產(chǎn)生過熱損傷，消融后腫瘤復(fù)發(fā)率仍較高。為確保熱消融臨床治療效果，實(shí)現(xiàn)一次性臨床滅活腫瘤，明確腫瘤消融安全邊界是其中關(guān)鍵。超聲造影對于動態(tài)識別腫瘤壞死區(qū)和非壞死區(qū)、即時(shí)評價(jià)消融治療效果、術(shù)后評估組織凝固壞死及腫瘤殘留情況等具有重要臨床價(jià)值[3-5]。本研究擬制備包裹液態(tài)全氟化碳的溫敏型脂質(zhì)納米粒(heat-sensitive lipid nanoparticle, HLNP)超聲造影劑，并觀察其評估微波消融邊界的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 主要材料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine, DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol, DPPG)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)、全氟戊烷(perfluoropentane，PFP)、膽固醇、氯仿(CHCl3)、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)及瓊脂糖粉。所用設(shè)備包括多功能微波治療儀(南京億高公司，ECO-100，功率可調(diào)10～80 W)，冷循環(huán)微波針(EO100C 2450 MHz，18G)，激光粒徑測量儀(Malvern公司)，Esaote MyLab90超聲診斷儀。

1.2 制備HLNP 將DSPE、DPPG、DPPC和膽固醇的混合物10 mg溶于含有5 ml氯仿的燒杯中，用封口膜封口，磁力攪拌至透明溶液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋蒸形成脂質(zhì)薄膜，而后加入2 ml PBS水合至薄膜完全溶解；以超聲波破碎儀在冰浴條件下乳化溶液，并在乳化過程中緩慢滴注200l PFP，最后經(jīng)過離心洗滌形成包裹PFP的HLNP，貯存于4℃冰箱內(nèi)。在光學(xué)顯微鏡下觀察納米粒大小、分布及外觀等情況，采用激光粒徑儀測量其粒徑。

1.3 HLNP體外熱相變實(shí)驗(yàn) 用去離子10倍水稀釋HLNP，取其中1滴置于載玻片上，蓋上蓋玻片放入加熱板中持續(xù)加熱；以倒置顯微鏡實(shí)時(shí)觀察HLNP熱相變進(jìn)程，記錄HLNP開始出現(xiàn)熱相變時(shí)的溫度值。

1.4 微波加熱含HLNP凝膠模型實(shí)驗(yàn) 按1%V/V將瓊脂糖粉溶于雙蒸水，加熱至瓊脂糖完全溶解后冷卻，制成瓊脂糖凝膠孔洞模型。以含HLNP凝膠模型為實(shí)驗(yàn)組，單純脂質(zhì)懸液凝膠模型為對照組，于超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下將冷循環(huán)微波消融針沿孔洞垂直方向穿入凝膠模型內(nèi)，微波針尖位置作為0點(diǎn)，在距離針尖2.5、3.5、4.5、5.5 cm的4個孔洞中分別加入等量HLNP，以微波治療儀(消融功率設(shè)定為60 W，消融時(shí)間為3 min)加熱凝膠模型，同時(shí)利用超聲診斷儀實(shí)時(shí)觀察凝膠孔洞模型中HLNP的超聲回聲變化情況，得到加熱前后凝膠模型中納米粒的二維超聲聲像圖。

1.5 HLNP評估微波消融離體牛肝邊界效果觀察 將復(fù)溫、脫氣后的新鮮離體牛肝切成6 cm×3 cm×3 cm塊狀備用。于超聲引導(dǎo)下將冷循環(huán)微波刀沿側(cè)面插入牛肝組織，利用超聲診斷儀實(shí)時(shí)定位并錨記穿刺點(diǎn)，確定納米粒進(jìn)針部位，擬定微波消融中心為0點(diǎn)，在距消融中心2.5 cm處沿垂直于肝表面方向局部注射納米粒，并以60 W微波消融牛肝3 min，超聲實(shí)時(shí)觀察離體牛肝與納米粒在微波消融作用下的聲像圖變化。而后切開牛肝，觀察注入HLNP處及微波消融處牛肝大體變化，并對牛肝組織進(jìn)行HE染色，觀察其病理學(xué)改變。對照組以脂質(zhì)懸液代替HLNP。

2 結(jié)果

2.1 HLNP一般理化特性 納米粒外觀呈乳白色混懸液，光學(xué)顯微鏡下納米粒大小均一，分布較均勻，分散度較好(圖1)。HLNP可于4℃條件下保持穩(wěn)定狀態(tài)3天，平均粒徑(507.90±101.70)nm(圖2)。

圖1 光鏡下觀察包裹PFP的HLNP(×400) 圖2 HLNP粒徑分布圖 (強(qiáng)度指某粒徑納米粒所占體積百分比)

2.2 體外HLNP熱相變 加熱板溫度達(dá)到45℃時(shí)開始出現(xiàn)納米粒相變所產(chǎn)生的微氣泡，且微氣泡直徑和數(shù)量逐漸增多，加熱至50℃ 1 min后產(chǎn)生大量氣泡。見圖3。

圖3 光鏡下觀察HLNP熱相變 A.加熱45℃時(shí)HLNP開始出現(xiàn)熱相變(×400)；B.50℃加熱1 min后產(chǎn)生大量氣泡(×400)

2.3 超聲觀察微波加熱凝膠模型 微波加熱前，二維超聲顯示HLNP組和對照組均為以無回聲為主, 伴周圍環(huán)狀稍高回聲。微波消融針加熱后，HLNP組距離微波消融針較近2個孔洞較輻照前回聲強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，呈密集高回聲，距離微波消融針較遠(yuǎn)2個孔洞較輻照前回聲強(qiáng)度也有所增強(qiáng)，周圍呈明顯高回聲；對照組4個孔洞超聲回聲強(qiáng)度較輻照前未見明顯改變。見圖4。

圖4 HLNP組凝膠模型及對照組體外超聲顯像 A、B.HLNP組微波加熱前(A)及加熱后(B)二維超聲聲像圖；C、D.對照組微波加熱前(C)及加熱后(D)二維超聲聲像圖；E.微波加熱含HLNP凝膠模型示意圖

2.4 微波消融含HLNP離體牛肝 隨著溫度升高，消融區(qū)牛肝產(chǎn)生明顯氣化區(qū)，注入HLNP納米粒處牛肝由弱回聲逐漸變?yōu)楦呋芈?，最終表現(xiàn)為強(qiáng)回聲后方伴聲影，形成明顯氣化區(qū)，切開牛肝組織肉眼觀察發(fā)現(xiàn)該處肝組織由紅色變?yōu)榘咨?。對照組僅消融區(qū)域牛肝產(chǎn)生氣化區(qū)，注入脂質(zhì)懸液處牛肝回聲及大體組織表現(xiàn)未見明顯變化(圖5)。對HLNP組變?yōu)榘咨珔^(qū)域組織行HE染色，光學(xué)顯微鏡下見牛肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死及脂肪變性(圖6)。

圖5 HLNP組和對照組微波消融離體牛肝效果 A～C.HLNP組微波消融離體牛肝前(A)、消融過程中(B)及消融后(C)超聲聲像圖；D.HLNP組微波消融牛肝及注入HLNP處牛肝大體變化；E～G.對照組微波消融離體牛肝前(E)、消融過程中(F)及消融后(G)超聲聲像圖；H.微波消融對照組牛肝及注入脂質(zhì)懸液處牛肝大體變化 (紅圈示消融位置)

圖6 HLNP組微波消融后牛肝組織病理圖示肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死(A, HE，×200，箭)及脂肪變性(B，HE，×100，箭)

3 討論

腫瘤局部熱消融技術(shù)包括射頻消融、微波消融、激光治療及高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focus ultrasound，HIFU)等[6]，主要原理是利用多種形式的物理方法將組織加熱到一定溫度，使其發(fā)生凝固性壞死，最終達(dá)到徹底殺滅癌細(xì)胞的目的；其中微波消融技術(shù)因升溫速度快、加熱效率高、消融時(shí)間較短且消融范圍大及凝固性壞死徹底等優(yōu)點(diǎn)而展現(xiàn)出較大優(yōu)勢[7-8]。臨床較常使用的微波頻率為2 450 MHz，消融能量較高，易于集中，但消融深度不足，且腫瘤形態(tài)不規(guī)則時(shí)，微波消融熱能分布不甚均勻；另外，腫瘤周圍的“血池效應(yīng)”亦影響微波消融熱場的分布[9]，使鄰近血管的腫瘤組織可能出現(xiàn)溫度過冷區(qū)，未達(dá)消融溫度而不能發(fā)生凝固性壞死，導(dǎo)致癌細(xì)胞殘留。因此，如何完全消融腫瘤，同時(shí)避免損傷鄰近膽囊、膽管、膈肌、腎臟或血管等重要臟器，是保證熱消融治療效果的關(guān)鍵，也是評價(jià)療效時(shí)備受關(guān)注的問題。

本實(shí)驗(yàn)所用PFP屬于液態(tài)全氟化碳化合物中的一種，其在大氣壓下的沸點(diǎn)是29℃，在加熱、超聲、激光等作用下易受到激發(fā)而產(chǎn)生液氣相轉(zhuǎn)變[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中HLNP在加熱板作用下產(chǎn)生大量氣泡，間接證實(shí)HLNP能發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變。另外，在微波熱效應(yīng)作用下，距離微波消融中心越近的凝膠孔洞模型超聲顯影效果越明顯，而對照組回聲未見明顯改變，說明納米粒能通過微波熱能傳遞達(dá)到相變溫度發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變，且凝膠孔洞中納米粒超聲增強(qiáng)顯像特征可作為評估微波消融邊界的潛在指標(biāo)，為離體牛肝實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

微波消融離體牛肝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用60 W、180 s的微波消融參數(shù)所產(chǎn)生的凝固灶縱徑約為3 cm，故在距離消融凝固灶縱徑邊界約1 cm處牛肝內(nèi)注入納米粒，模擬腫塊微波消融凝固灶與毗鄰重要組織臟器的界限，且避開微波消融產(chǎn)生的氣化區(qū)，以利于實(shí)時(shí)觀察鄰近重要組織器官一側(cè)的離體牛肝注入納米粒后在微波消融作用下產(chǎn)生的效果。既往有學(xué)者[12]采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)殼材包裹液態(tài)全氟化碳制備的納米粒可通過加熱發(fā)生液氣相變，并可通過超聲實(shí)時(shí)顯像確認(rèn)腫瘤消融邊界。已有研究[13]證實(shí)包裹PFP的納米粒能在微波消融作用下發(fā)生相變，同時(shí)增強(qiáng)微波消融效果。本實(shí)驗(yàn)通過超聲實(shí)時(shí)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)距消融凝固灶邊緣約1 cm處注入HLNP的牛肝經(jīng)過微波消融產(chǎn)生明顯氣化區(qū)，超聲可見該處回聲由弱逐漸增強(qiáng)的變化過程；牛肝組織大體顏色由紅色變?yōu)榘咨夜忡R下觀察發(fā)現(xiàn)該處牛肝細(xì)胞有明顯點(diǎn)狀壞死和脂肪變性。上述結(jié)果表明，HLNP受到微波熱效應(yīng)傳遞的影響后發(fā)生液氣相變，使得消融區(qū)與鄰近正常組織之間的對比度增加，在微波消融氣化區(qū)周圍注入納米粒的牛肝處形成明顯氣化區(qū)，有助于通過觀察超聲變化和大體變化，以識別微波消融灶與周圍組織的界限；注入納米粒處牛肝超聲回聲明顯增強(qiáng)提示微波消融達(dá)到安全邊界，有利于避免損傷鄰近組織，最大程度地消融腫瘤，減少腫瘤殘留和復(fù)發(fā)；同時(shí)可根據(jù)腫瘤與周圍組織臟器的距離設(shè)定納米粒與微波消融氣化區(qū)的距離。既往文獻(xiàn)[14]報(bào)道，正常組織細(xì)胞的溫度安全界限為(45±1)℃，本研究中HLNP的相變溫度與之相近，提示HLNP不僅有助于評估腫瘤消融邊界，還能使微波消融在最大限度殺傷腫瘤組織的同時(shí)保護(hù)周圍組織臟器不受損傷，尤其對于特殊位置的腫瘤，如鄰近肝門、膽管、下腔靜脈等重要血管、臟器者。

綜上所述，HLNP有望成為用于評估微波消融邊界的熱敏劑，結(jié)合超聲成像實(shí)時(shí)監(jiān)控微波消融效果能提高微波消融的可控性和安全性。