右美托咪定對布比卡因抑制大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響研究

陳鴻飛 金周晟 夏芳芳 蔡瑤瑤 劉樂

布比卡因是酰胺類局部麻醉藥之一，其鎮(zhèn)痛效果好、作用時間長，在臨床麻醉有一定應(yīng)用前景。但是布比卡因誤入血管可引發(fā)心律失常甚至心臟停搏，其毒性得到廣泛關(guān)注[1-6]。右美托咪定是常用于區(qū)域阻滯的鎮(zhèn)靜藥物和局部麻醉藥物的輔佐藥，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜和延長局部麻醉藥鎮(zhèn)痛時間的效果[7-8]。有研究表明右美托咪定可增強(qiáng)大鼠對布比卡因的耐受力，但具體機(jī)制尚不明確[9]。布比卡因的心臟毒性主要由心肌細(xì)胞鈉通道被阻滯引起[10]，目前鮮有右美托咪定對布比卡因抑制心肌細(xì)胞鈉電流（sodium current，INa）影響的研究。本研究觀察右美托咪定對布比卡因抑制的大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇雄性SD大鼠（動物許可號SYXK 2015-009）5 只，鼠齡 8～9 周，體重 275～310 g。由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心供應(yīng)，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物中心屏障環(huán)境。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和配方 試劑：牛血清白蛋白、二甲基亞砜、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid,HEPES）、乙二醇雙四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA）、氯化銫、谷氨酸、?；撬帷⒙然}、鎂ATP和氫氧化銫購于美國Sigma試劑公司。布比卡因粉劑（批號:BCBM7058V）購于美國Sigma試劑公司，注射用鹽酸右美托咪定（批號：190428BP）由江蘇恒瑞制藥有限公司提供。臺氏液配方：氯化鈉137 mmol/L、氯化鉀5.4 mmol/L、氯化鈣1.8 mmol/L、氯化鎂1.0 mmol/L、磷酸二氫鈉0.33 mmol/L、HEPES10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L，氫氧化鈉調(diào)pH至7.4±0.5，無鈣臺氏液為臺氏液中去除氯化鈣。KB（kraft-bruhe solution，KB）液配方：氯化鉀 40 mmol/L、磷酸二氫鉀 20 mmol/L、硫酸鎂3.0 mmol/L、氫氧化鉀 80 mmol/L、谷氨酸 50 mmol/L、牛磺酸 20 mmol/L、HEPES10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、EGTA0.5 mmol/L，氫氧化鉀調(diào)pH至7.4±0.5。細(xì)胞外液配方：氯化膽堿140 mmol/L、氯化鈉20 mmol/L、氯化鎂1.0 mmol/L、HEPES 5.0 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、氯化銫4.6 mmol/L，氫氧化銫調(diào)pH至7.4±0.5。電極內(nèi)液配方：氯化銫120 mmol/L、氫氧化鈉10 mmol/L、氯化鎂1.0 mmol/L、 鈉 ATP 5.0 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，氫氧化銫調(diào)pH至7.3±0.5。所有液體使用前均采用95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)充15 min。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌細(xì)胞分離[11-12]采用腹腔注射80 mg/kg鹽酸氯胺酮和12 mg/kg甲苯噻嗪進(jìn)行麻醉，腹腔注射500 U/kg肝素防止冠狀動脈內(nèi)微血栓形成。大鼠無反射后以斷頭法處死，然后剪下心臟置于4℃臺氏液，立即分離主動脈，然后連接到Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)進(jìn)行灌流。維持溫度為36～37℃，流速為10～12 ml/min。先采用無鈣臺氏液灌流3 min以去除離體心臟中的血液，然后在30 ml無鈣臺氏液中加入Ⅰ型膠原酶（1 mg/ml）、ⅤⅠⅩ型蛋白酶（0.05 mg/ml）和氯化鈣（50 μmol/l）進(jìn)行循環(huán)灌流10 min。隨后剪下左心室部分，剪成約1 mm3碎片置入KB液中，用塑料滴管輕輕吹打3 min，使其分離成單心室肌細(xì)胞。采用100目微孔濾膜過濾后，留取含心室肌細(xì)胞的濾液，靜置1 h后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)實驗。

1.2.2 分組和灌流方案 建立Langendorff模型灌流酶解獲得心室肌細(xì)胞32個，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：Bupi組、Dex組、Bupi+Dex組和空白對照組，每組8個心室肌細(xì)胞。Bupi組細(xì)胞灌流含布比卡因（50 μmol/l）的細(xì)胞外液；Dex組細(xì)胞灌流含右美托咪定（50 ng/ml）的細(xì)胞外液；Bupi+Dex組細(xì)胞灌流含布比卡因（50 μmol/L）復(fù)合右美托咪定（50 ng/ml）的細(xì)胞外液；空白對照組細(xì)胞灌流空白細(xì)胞外液。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄INa采用德國HEKA公司的EPC 10膜片鉗放大器進(jìn)行電流記錄，電壓刺激信號和電流采集由德國HEKA公司pulse 8.0軟件完成。采用微電極拉制儀完成玻璃電極的拉制，尖端直徑1～1.5 μm，入液后電阻1.0～2.5 MΩ。為排除鉀離子對INa的記錄影響，電極內(nèi)液和細(xì)胞外液的氯化鉀由氯化銫代替。為了減少鉗位誤差，將細(xì)胞外液中的氯化鈉濃度控制為20 mmol/L，氯化膽堿為140 mmol/L，以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。當(dāng)心室肌細(xì)胞和電極形成穩(wěn)定的封接后，開始記錄電流。記錄4組大鼠心室肌細(xì)胞以下指標(biāo)：（1）灌流前后的INa峰值，其中INa基礎(chǔ)峰值為灌流前測定的INa的峰值，INa灌流后峰值為灌流后穩(wěn)定5 min測定INa的峰值。電流峰值采用電流密度表示，電流密度 = 電流值（nA）/細(xì)胞電容（pF）。（2）灌流后INa原始電流圖。（3）計算INa峰值抑制值，INa峰值抑制值 =（INa灌流后峰值/INa基礎(chǔ)峰值）×100。（4）灌流前后的INa的I-V曲線。刺激參數(shù)：鉗制電位-90 mV，電位從-90 mV逐步上升為+50 mV，電位階躍10 mV，刺激波寬為10 ms，刺激頻率0.2 Hz。根據(jù)4組I-V曲線得出大鼠心室肌細(xì)胞INa的激活電位和反轉(zhuǎn)電位，其中出現(xiàn)INa峰值的膜電位為峰值電位，開始激活I(lǐng)Na時的膜電位為激活電位，INa值為零時的膜電位為反轉(zhuǎn)電位。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Origin 8.0軟件對測量后的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流前后INa峰值的比較見表1。

表1 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流前后INa峰值的比較

由表1可見，灌流前，4組大鼠心室肌細(xì)胞的INa基礎(chǔ)峰值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。灌流后，Bupi組、Dex組和Bupi+Dex組的INa灌流后峰值均低于空白對照組，Dex組、Bupi+Dex組灌流后峰值均高于Bupi組，Bupi+Dex組的INa灌流后峰值低于Dex組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流后INa原始電流圖 見圖1。

圖1 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流后INa原始電流圖

由圖1可見，空白對照組的灌流后INa峰值高于其他3組。同時，Bupi組灌流后INa峰值在4組中最低，其次為Bupi+Dex組。

2.3 4組大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值抑制值的比較 見圖2。

圖2 4組大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值抑制值的比較

由圖2可見，灌流后，Bupi組、Dex組和Bupi+Dex組的INa峰值抑制值均高于空白對照組，Dex組和Bupi+Dex組的INa峰值抑制值低于Bupi組，Bupi+Dex組的INa峰值抑制值高于Dex組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流后INa的I-V曲線比較見圖3。

圖3 4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流后INa的I-V曲線比較

由圖3可見，4組大鼠心室肌細(xì)胞灌流后INa峰值電位均出現(xiàn)在-30 mV時。4組大鼠心室肌細(xì)胞INa的激活電位均出現(xiàn)在-60 mV時，反轉(zhuǎn)電位出現(xiàn)在+20 mV時，4組激活電位和反轉(zhuǎn)電位基本相同。

3 討論

自1979年首例報道布比卡因毒性以來，對布比卡因毒性的研究一直在進(jìn)行，而且不斷深入[13]。布比卡因心臟毒性機(jī)理可能是其阻斷了心肌細(xì)胞鈉通道、鈣通道和鉀通道以及干擾線粒體的能量代謝等[10，14-16]。

既往動物和臨床研究表明，右美托咪定可作為局部麻醉藥輔佐劑增強(qiáng)局部麻醉藥鎮(zhèn)痛效果和延長鎮(zhèn)痛時間。Brummett等[17]研究表明右美托咪定可增強(qiáng)布比卡因?qū)ψ巧窠?jīng)感覺和運動的阻滯，而且未觀察到神經(jīng)毒性反應(yīng)。在行腋路臂叢神經(jīng)阻滯時，右美托咪定可縮短左旋布比卡因的起效時間，并延長其作用時間[18]。既往發(fā)現(xiàn)在采用羅哌卡因行肌間溝神經(jīng)阻滯時，右美托咪定也有類似作用[19]。右美托咪定作為鎮(zhèn)靜劑在區(qū)域阻滯中也得到了廣泛應(yīng)用。有研究表明右美托咪定靜脈使用可延長局部麻醉藥的感覺和運動阻滯時間，使首次出現(xiàn)疼痛的時間延后[20]。右美托咪定靜脈的應(yīng)用還可以改善利多卡因鎮(zhèn)痛質(zhì)量，減少其他鎮(zhèn)痛藥物的使用[21-22]。

正因為右美托咪定和局部麻醉藥同時使用的概率增加，右美托咪定對局部麻醉藥心臟毒性的影響更值得關(guān)注。早在1993年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)α2受體激動劑可樂定可以減輕布比卡因心臟毒性，但是并不能解釋具體機(jī)制[23]。Hanci等[9]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過右美托咪定預(yù)處理后，SD大鼠對布比卡因有更好的耐受力，不過缺乏具體機(jī)制探討。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究了右美托咪定對布比卡因所致的大鼠心室肌INa的影響。研究中采用的右美托咪定濃度50 ng/mL接近臨床濃度，而布比卡因50 μmol/L來源于前期研究結(jié)果[12]。該研究比較了40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因?qū)Na峰值的抑制作用，發(fā)現(xiàn)濃度50 μmol/L布比卡因抑制INa峰值效果更明顯。本研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定單獨存在時也可以輕度抑制大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值。既往研究同樣發(fā)現(xiàn)右美托咪定對神經(jīng)細(xì)胞的INa有抑制作用[24]，這與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，右美托咪定和布比卡因混合后，可降低布比卡因?qū)Na峰值的影響。猜測這一作用的原因是右美托咪定可以和布比卡因競爭性結(jié)合鈉通道，類似經(jīng)典的納洛酮拮抗阿片類藥物中毒。由于鈉通道是布比卡因心臟毒性的主要靶點，因此右美托咪定減輕布比卡因?qū)Na的抑制，有可能是其減輕布比卡因心臟毒性的機(jī)制之一，具體需要進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，右美托咪定可部分恢復(fù)布比卡因所抑制的INa，這一作用是否參與了右美托咪定增強(qiáng)布比卡因心臟毒性耐受性過程，還需要進(jìn)一步研究確定。