腫瘤浸潤性免疫細胞對肺腺癌預后影響的研究

施春波 董長征 陳磊 翁磊

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的亞型，其組織學亞型又以肺腺癌多見。目前關于肺腺癌治療與預后評估主要依據(jù)TNM分期，而手術切除是早期肺腺癌的治療手段[2]；雖然手術切除可以提高生存率，但是仍有近1/4的患者出現(xiàn)復發(fā)[3-4]。因此，準確評估肺腺癌復發(fā)風險具有重要意義。免疫反應是許多特異性細胞之間相互協(xié)調的過程，對肺腺癌臨床結局可造成一定的影響[5]。據(jù)報道，腫瘤浸潤性免疫細胞（簡稱免疫細胞）的功能和組成會隨著宿主免疫狀態(tài)變化而改變，并可能成為特定藥物的有效靶點。CIBERSORT（通過估計RNA轉錄物的相對亞群來識別細胞類型）是一種基于基因表達的反卷積算法，利用一組條形碼基因表達值來表示免疫細胞組成。與傳統(tǒng)的免疫組化、流式細胞術等試驗方法相比，CIBERSORT能全面、快速、準確地推斷22種免疫細胞在腫瘤中的相對浸潤比例[6]。近年來有不少研究采用該方法探討22種免疫細胞對預后的影響[7-9]。本研究利用CIBERSORT計算肺腺癌中22種免疫細胞的浸潤比例，并構建免疫風險評分模型及列線圖來預測肺腺癌的復發(fā)風險，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)獲取 本研究肺腺癌轉錄組數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫TCGA[10]。通過UCSC Xena網站（https://xenabrowser.net/）輸入關鍵詞“肺腺癌”下載TCGA數(shù)據(jù)庫中594例肺腺癌患者的轉錄組數(shù)據(jù)，包括正常肺組織樣本59例,肺腺癌組織樣本535例。同時獲取523例肺腺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、TNM分期、預后等。最后利用R軟件的limma包對下載的肺腺癌轉錄組數(shù)據(jù)進行校正。

1.2 腫瘤中免疫細胞浸潤狀態(tài)評估 利用CIBERSORT軟件對校正后的肺腺癌轉錄組數(shù)據(jù)中22種免疫細胞的相對浸潤比例進行推算。首先，將校正后的轉錄組數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網站（http://cibersort.stanford.edu/），將算法設置為1 000排。數(shù)據(jù)集中每個樣本將會得到一個P值，最終篩選出P＜0.05的樣本作進一步研究。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0和R 3.5.3統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用兩獨立樣本t檢驗；呈偏態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用Mann-Whitney U檢驗。繪制Kaplan-Meier曲線，采用log-rank檢驗比較不同復發(fā)風險患者的總生存率。繪制ROC曲線分析復發(fā)預測模型的診斷效能。單因素Cox回歸模型用于分析單個變量對生存的影響，多因素Cox回歸模型用于分析與生存相關的獨立預測因子，利用Cox回歸模型分析中的回歸系數(shù)構建列線圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 22種免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達 利用CIBERSORT篩選出517例P＜0.05的樣本進行研究，其中正常肺組織樣本56例，肺腺癌組織樣本461例。對22種免疫細胞在正常肺組織、肺腺癌組織中的表達進行比較，結果顯示除CD8+T細胞、幼稚的CD4+T細胞、激活的自然殺傷細胞（NK細胞）及激活的肥大細胞外，其余免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1a（插頁）。主成分分析結果顯示，正常肺組織與肺腺癌組織的免疫浸潤情況有明顯的組偏聚類和個體差異，見圖1b（插頁）。

圖1 腫瘤浸潤性免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達（a：小提琴圖，藍色代表正常肺組織，紅色代表肺腺癌組織，NK細胞為自然殺傷細胞；b：主成分分析圖，紅色代表正常肺組織，綠色代表肺腺癌組織）

圖2 免疫風險評分模型（a：Kaplan-Meier生存曲線；b：ROC曲線；c：風險評分；d：生存狀態(tài)；e：免疫浸潤模式）

2.2 22種免疫細胞對肺腺癌患者預后的影響 利用單因素Cox回歸模型對22種免疫細胞進行分析，以尋找與肺腺癌總生存有統(tǒng)計學差異的預后亞群。結果顯示嗜酸性粒細胞（HR=4.08E+17，95%CI：1 560.24～1.07E+32，P＜0.05）、激活的樹突狀細胞（HR=79.44，95%CI：1.54～4 107.17，P＜0.05）、M1 型巨噬細胞（HR=30.42，95%CI：1.24～747.63，P＜0.05）均與肺腺癌預后較差有關，見表1。

2.3 基于3種免疫細胞的免疫風險評分模型構建與評價 假設上述單因素Cox回歸分析篩選的3種免疫細胞對肺腺癌的總體生存有影響，將這3種免疫細胞作為一個獨立的預測信號來預測患者的復發(fā)風險。采用多因素Cox回歸法對這3種免疫細胞構建免疫風險評分模型。根據(jù)模型對每例患者進行復發(fā)風險評分，按風險評分中位值將患者分為高風險組與低風險組，Kaplan-Meier曲線提示高風險組患者總生存率低于低風險組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2a（插頁）。ROC曲線顯示，該風險模型在預測復發(fā)風險方面具有較好的診斷效能（AUC=0.60），見圖2b（插頁）。肺腺癌患者的風險評分、生存狀態(tài)及免疫浸潤模式見圖2c-e（插頁）。

表1 22種腫瘤浸潤性免疫細胞對肺腺癌患者預后的影響

2.4 免疫風險評分模型對肺腺癌預后的獨立預測價值 為探索構建的免疫風險評分模型對肺腺癌預后風險的預測是否獨立于患者年齡、性別、TNM分期等臨床病理參數(shù)，筆者對免疫風險評分、年齡、性別、TNM分期進行了多因素Cox回歸分析。結果顯示免疫風險評分模型（HR=1.30，95%CI：1.20～1.40，P＜0.05）、TNM 分期（HR=1.70，95%CI：1.49～2.10，P＜0.05）是肺腺癌預后的獨立預測因子。

2.5 預測肺腺癌患者生存率的列線圖構建 建成的預測肺腺癌患者生存率的列線圖見圖3。

3 討論

除惡性腫瘤細胞外，癌組織還包括免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞以及大量細胞因子、趨化因子、生長因子。這些組件及它們之間的相互作用構成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境對惡性細胞具有抑制作用，但是腫瘤細胞在進展過程中會避開這些抑制性信號，利用免疫細胞及其他有利條件促進自身的生長、侵襲及轉移[11]。眾所周知，在免疫細胞和腫瘤基質中的惡性細胞之間，事實上存在著復雜的生物學過程，且具有明顯的預后相關性。例如在結直腸癌患者中，M1型巨噬細胞及激活的樹突狀細胞與較好的預后相關，而M2型巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞與預后不良相關[12]。Zhou等[9]基于免疫細胞構建了預后免疫風險評分模型，該模型是結腸癌患者無復發(fā)生存的獨立預測因子，且較TNM分期有更好的預測價值。

圖3 預測肺腺癌患者生存率的列線圖

手術切除后腫瘤復發(fā)是影響肺腺癌患者總生存的重要因素之一。因此，準確評估患者復發(fā)風險對于肺腺癌患者總生存的改善至關重要。為了全面探索免疫細胞預測肺腺癌患者預后的價值，筆者采用CIBERSORT對肺腺癌組織中22種免疫細胞的相對浸潤比例進行推算，并選取P＜0.05的樣本用于研究。單因素Cox回歸分析顯示，嗜酸性粒細胞、激活的樹突狀細胞及M1型巨噬細胞均與肺腺癌患者較差的預后相關。基于這3種免疫細胞，筆者采用多因素Cox回歸模型構建了免疫風險評分模型，而ROC曲線分析顯示該模型預測肺腺癌復發(fā)風險是可靠的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)幼稚B細胞、記憶B細胞、漿細胞、CD4+T細胞、濾泡輔助T細胞、調節(jié)性T細胞、NK細胞、肥大細胞、單核細胞等對肺腺癌預后的預測價值雖然不大，但是在正常肺組織與肺腺癌組織中存在差異表達，表明這些細胞與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

綜上所述，本研究證明了免疫細胞在肺腺癌預后評估中的價值，本文基于3種免疫細胞構建的免疫風險評分模型是肺腺癌預后的獨立預測因子。但本研究不可避免地存在一定的局限性：（1）公開數(shù)據(jù)庫集中發(fā)布的數(shù)據(jù)量有限，本研究用于分析的臨床病理參數(shù)不全面，可能導致潛在的錯誤或偏倚；（2）未考慮與免疫浸潤位置相關的免疫微環(huán)境的異質性；（3）為構建免疫風險評分模型而下載的所有數(shù)據(jù)均來自西方國家，因此該研究成果在亞洲國家患者身上不一定適用，需要進一步研究加以驗證。