姬美石斛快繁體系的建立

彭 楊，陳 朋，李 娜，楊蕾蕾

（深圳市中國科學院仙湖植物園，廣東深圳 518004）

姬美石斛（Hibiki） 是以長苞石斛（Dendrobium bracteosum Rchb.f.）和亮葉石斛（D.laevifolium laevifolium Stapf）為親本的石斛雜交種，其花期覆蓋春、夏、秋三季，長達半年，并且花色艷麗，以持久的花期和可觀的花量而受到蘭花愛好者的廣泛歡迎，是出色的園藝品種。姬美石斛近年來引進于泰國和日本，各大花市只能偶爾見到少量銷售。

傳統(tǒng)的石斛屬植物主要通過分株和枝條扦插方式進行繁殖，不僅繁殖效率低下，而且所得種苗大小不一，難以達到市場要求標準。通過組織培養(yǎng)進行植株的再生，可以得到整齊且花期一致的種苗，目前組織培養(yǎng)技術已在鐵皮石斛[1]、金釵石斛[2-3]和多種雜交的石斛品種[4-5]中得以應用。植物生長調(diào)節(jié)劑在石斛屬植物組織培養(yǎng)中起到重要的作用，如TDZ 在澳洲鴿子石斛（D.kingianum Bidwill ex Lindl.）的組織培養(yǎng)過程中可以起到有效誘導類原球莖，并促進叢生芽增殖的作用[6]，而6-BA、NAA 和KT 的聯(lián)合使用，對高山石斛（D.infundibulum Lindl.）的增殖具有良好的效果[7]。本試驗以MS 為基礎培養(yǎng)基，通過添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑和有機添加物，對姬美石斛的組織培養(yǎng)技術進行研究，以期獲得高效率、低成本的規(guī)?；?、標準化生產(chǎn)技術，為姬美石斛在市場上的廣泛推廣提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取姬美石斛新生枝長2～3cm 的莖尖，0.1%升汞溶液消毒處理6min，無菌條件下去除莖尖上的葉片和包裹的葉鞘，無菌水沖洗4～6 次，獲得外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對姬美石斛叢生芽增殖的影響。分析6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、激動素（KT）和萘乙酸（NAA）對叢生芽的影響：以MS 為基本培養(yǎng)基，設置不同濃度的6-BA（0.2～2mg/L）與NAA（0.5mg/L）共組成5個處理（培養(yǎng)基編號為A1～A5，見表1），探究6-BA 對姬美石斛叢生芽增殖的影響；設置不同濃度的KT（0.2～2mg/L）與NAA（0.5mg/L）共組成5 個處理（培養(yǎng)基編號為B1～B5，見表1），探究KT 對姬美石斛叢生芽增殖的影響；設置不同濃度的NAA（0.1～1.5mg/L）與6-BA（1mg/L）共組成5 個處理（培養(yǎng)基編號為C1～C5，見表2），探究NAA 對姬美石斛的叢生芽增殖的影響。培養(yǎng)60d 后進行統(tǒng)計，篩選出最適叢生芽增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合。

1.2.2 不同有機添加物對姬美石斛叢生芽增殖的影響。以添加了6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 的MS 培養(yǎng)基為基礎，分別添加30g/L 桃泥、椰汁、香蕉泥和蘋果泥4種有機物，共組成5 個處理（培養(yǎng)基配方為D1～D5，見表3），探究有機添加物對姬美石斛叢生芽增殖的影響，培養(yǎng)60d 后進行統(tǒng)計，篩選出最適叢生芽增殖的有機添加物種類。

以上各培養(yǎng)基均添加30g/L 蔗糖、6g/L 瓊脂粉，pH值調(diào)節(jié)至5.8～6.0 之間。培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時間為16h，光照強度為37～40μmol/m2·s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

增殖系數(shù)=新形成的芽數(shù)/接種時的芽數(shù)。

選取大小均勻、苗齡一致的姬美石斛芽，隨機進行接種，每處理10 瓶，每瓶3 個單芽，重復3 次。方差分析采用SPSS 20.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件One-way ANOVG 方法進行，用LSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對姬美石斛叢生芽增殖的影響

2.1.1 6-BA、KT 對姬美石斛叢生芽增殖的影響。在MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA 或KT 均能促進姬美石斛叢生芽的增殖（表1）。6-BA 濃度在0.2～1.0mg/L之間，植株叢生芽的增殖系數(shù)整體呈上升趨勢，與6-BA 濃度呈正相關趨勢，但在6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L 組合時，增殖系數(shù)低至1.67，而在2.0mg/L 6-BA 時又具有顯著增殖效果。在MS 基本培養(yǎng)基中，不同濃度KT 的添加都具有顯著增殖效果，并在其濃度相對較低（0.2mg/L）時，增殖系數(shù)最高?？瞻讓φ战M中，增殖系數(shù)較小，植株細弱矮小，但其主根較為發(fā)達。

2.1.2 NAA 對姬美石斛叢生芽增殖的影響。在MS 基本培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0mg/L 的條件下，添加濃度范圍0.1～1.5mg/L 的NAA 都能明顯地促進姬美石斛叢生芽的增殖。當NAA 濃度達到1.0mg/L 以上時，與空白對照組相比具有顯著的增殖效果，在濃度達到1.5mg/L時，增殖系數(shù)最高，但植株的根部發(fā)生膨大，出現(xiàn)畸形。

根據(jù)以上15 組植物生長調(diào)節(jié)劑組合產(chǎn)生的增殖效果，結合植株生長狀態(tài)綜合判斷，認為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 的培養(yǎng)基為最適姬美石斛叢生芽增殖培養(yǎng)基。

2.2 有機添加物對姬美石斛增殖的影響

圖1 叢生芽增殖與植株再生

在MS 基本培養(yǎng)基中添加桃泥、蘋果泥和香蕉泥3種有機物，都對姬美石斛叢生芽增殖具有一定程度上促進作用，其增殖效果由強到弱依次為桃泥＞蘋果泥＞香蕉泥，其中添加桃泥的培養(yǎng)基具有顯著的增殖效果；蘋果添加物能使其在生根數(shù)量上具有顯著作用。椰汁的添加不僅不能起到促進作用，反而對姬美石斛的生長產(chǎn)生了一定的抑制，導致其增殖系數(shù)顯著低于空白對照組，生長狀態(tài)也不如空白對照組。

2.3 移栽

石斛類植物多是附生植物，喜歡通風透氣，商品化培養(yǎng)多使用水苔、樹皮和椰殼等基質(zhì)于容器中進行。因此，將高約3cm 的植株植于濕潤的水苔中煉苗，1 個月后移栽于直徑約1cm 樹皮基質(zhì)中，置于陰涼通風處，溫度保持18～25℃，濕度70%左右，成活率可達85%。

3 討論

表1 6-BA 和KT 對叢生芽增殖的影響

表2 NAA 對叢生芽增殖的影響

表3 不同有機添加物對叢生芽增殖的影響

植物組織培養(yǎng)技術是實現(xiàn)快速繁殖同時也是保存母本性狀的有效手段，常應用于瀕危和珍稀物種的保育工作[8-9]，也是性狀優(yōu)良的園藝品種生產(chǎn)方式，尤其是在蘭科植物的生產(chǎn)中廣泛應用[10]。石斛是蘭科植物中的重要組成類群，也是重要的園藝品種類群之一。石斛的組織培養(yǎng)通常使用嫩葉、莖尖等作為外植體，通過愈傷組織、類原球莖增殖或者叢生芽增殖的方式進行[11]。不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑在其增殖方式和增殖效率上都起著非常重要的作用。已有的研究表明，2,4-D 能夠誘導澳洲鴿子石斛愈傷組織的產(chǎn)生，而6-BA 和TDZ 的不同濃度組合能夠有效誘導其愈傷和類原球莖的增殖和分化[6]。愈傷組織或者類原球莖的增殖效率遠遠高于叢生芽的增殖方式，但在研究中發(fā)現(xiàn)，愈傷和類原球莖在增殖過程中容易發(fā)生較高的變異[12]，因此，在實際生產(chǎn)中通常采用叢生芽增殖的方式來保證園藝品種的優(yōu)良性狀。石斛屬植物叢生芽增殖過程中多使用KT、6-BA 和NAA 3 種植物生長調(diào)節(jié)劑的組合，最適組合的濃度因不同的種或品種而有所差異，比如澳洲鴿子石斛叢生芽在KT 2.0mg/L 與NAA 0.5mg/L 組合下增殖系數(shù)最高[6]，翅萼石斛則為6-BA 1.0mg/L 與NAA 0.1mg/L[13]，也有在低細胞分裂素、高生長素的組合下最適叢生芽增殖的石斛品種[5]。本試驗發(fā)現(xiàn)，6-BA 1.0mg/L 與NAA 1.0mg/L 組合最利于姬美石斛叢生芽的增殖，6-BA 濃度增高或者KT 的使用都會促進組培過程中高位芽的生長，NAA 過高的濃度則會引起根部膨大畸形。石斛高位芽的生長屬于其自身的營養(yǎng)繁殖方式[14]，不利于叢生芽的快速增殖，推測可能是受到過高濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的脅迫而發(fā)生的現(xiàn)象。

蘭科植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常加入多樣的添加物促進原球莖或叢生芽的快速增殖[15]。這些添加物中因含有不同的植物生長調(diào)節(jié)劑或氨基酸等物質(zhì)，對植物組織的增殖具有不同的效果，比如椰汁中因含有細胞分裂素（CK，cytokinins）能夠刺激原球莖或類原球莖的形成和增殖，同時也對芽和葉片的形成具有一定的影響[16]。蘋果泥、香蕉泥和土豆泥也常作添加物使用，在澳洲鴿子石斛組培中發(fā)現(xiàn)，香蕉、椰汁、土豆的添加有助于植株長高，而蘋果和土豆的添加能夠使莖增粗[6]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，桃泥和蘋果泥的添加能夠促進叢生芽的增殖，并且蘋果添加物對生根的促進作用明顯。

姬美石斛的煉苗和移栽養(yǎng)護過程要注意栽培基質(zhì)的含水量和空氣濕度以及溫度的控制，通常在溫度保持18～25℃，濕度70%左右的條件下即可正常生長。