王宇光 王 軍 楊錦玲 蔡彩虹 蓋翠娟 梅文莉 戴好富
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/海南省沉香工程技術(shù)研究中心 海南???71101)
沉香是中國、日本、印度以及其他東南亞國家的傳統(tǒng)名貴藥材,在中醫(yī)中作為組方配伍,應(yīng)用于消化、呼吸、心腦血管等疾病的治療[1]。沉香具有神經(jīng)保護、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、解痙、降血糖、治療過敏及改善慢性腎衰竭等作用[2-8];其次,沉香的香料價值較高,被世界五大宗教(佛教、道教、伊斯蘭教、回教和天主教)所用。從沉香中提取的精油在中東國家備受消費者青睞,近年來,在化妝品等日用品方面得到廣泛應(yīng)用;第三,沉香工藝品具有文化收藏價值,其經(jīng)濟價值可觀。因此,沉香產(chǎn)業(yè)有很好的發(fā)展前景[9]。
由于野生資源的枯竭,自20 世紀80 年代,世界各個國家開始重視沉香植物的人工栽培。目前,在中國(廣東、海南、廣西和云南等省區(qū))、馬來西亞、越南等東南亞國家均大量種植沉香植物。國產(chǎn)沉香的基源植物為白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.],關(guān)于白木香優(yōu)良品種系統(tǒng)選育的報道較少。目前,白木香種子苗未經(jīng)過系統(tǒng)篩選,種質(zhì)參差不齊[10]。因此,加強種質(zhì)資源的調(diào)查,開展優(yōu)良品種選育,通過無性繁殖技術(shù)來培育易產(chǎn)香、產(chǎn)量高、品質(zhì)好的優(yōu)良品系[11],對沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要的現(xiàn)實意義。
中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所在前期分別篩選了2個白木香優(yōu)良嫁接無性系“熱科1 號”(瓊R-ETS-AS-010-2016) 和‘熱科2 號’(瓊R-ETS-AS-003-2017),楊錦玲等[12]已報道了‘熱科1號’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成份,但關(guān)于‘熱科2號’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成份方面未見報道。沉香中的特征性成分主要為2-(2-苯乙基)色酮和倍半萜2類化合物[13-14],但不同白木香品系生產(chǎn)的沉香的化學(xué)成分存在較大差異。本文采用GC-MS技術(shù)分析‘熱科2號’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分,以期獲得對‘熱科2號’的評價。
1.1.1 儀器
色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀,型號為HP6890/5975C GC/MS,美國安捷倫公司制造;色譜柱為彈性石英毛細管柱HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm);稱量使用萬分之一電子秤,型號為BP221S,由北京賽多利斯天平有限公司生產(chǎn);萃取均質(zhì)用美國BRANSONIC-5510E-DTH 超聲波清洗儀。氣質(zhì)中使用的試劑均為分析純。
1.1.2 試劑
GC-MS 中使用的試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。
1.1.3 樣品
均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所‘熱科2 號’試驗基地?!疅峥? 號’植株樹齡為5年。結(jié)香方法:砍傷法。結(jié)香部位:樹干中部。結(jié)香時間:2 年。分別從‘熱科2 號’樹干上砍傷所致結(jié)香部位挑取樣品放入塑料密封樣品袋中,每棵樹取一份樣品,編號為S1-S17。同時取同地點同樹齡和同樣結(jié)香的普通白木香沉香樣品為對照,記為普通白木香沉香樣品(簡稱普,S0)。憑證標本均存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。
1.2.1 樣品制備
分別精確稱取各沉香樣品3.000 0 g,分別用50 mL 乙醚在冰水浴下超聲萃取30 min,靜置5 min后過濾得到乙醚提取液。重復(fù)提取3 次,合并3 次提取液。
1.2.2 GC-MS分析
質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;接口溫度280℃;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1 434 V;質(zhì)量掃描范圍20~550 m/z。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2005和Wiley 275 標準質(zhì)譜圖,并借鑒前人和本研究組前期的鑒定方法[14],比對鑒定化合物。
色譜條件:色譜柱為彈性石英毛細管柱HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:柱溫50℃,保持2 min,以5℃/min 升溫至310℃,保持10 min;汽化室溫度250℃;載氣為高純He(99.999%);載氣流量1.0 mL/min;不分流;溶劑延遲時間:3.0 min。
1.2.3 GC-MS指紋圖譜的建立與分析
參照楊錦玲等[15]的方法,將17 個樣品(S1-S17)的GC-MS 總離子流圖轉(zhuǎn)換成文本格式,導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A 版”軟件中,設(shè)定S17 為參照圖譜,選取“時間窗寬度”為0.1 min,經(jīng)多點校正,自動匹配,建立GC-MS指紋圖譜,并對不同樣品的共有成份和指紋圖譜特征進行分析。
從GC-MS 分析的總離子流圖譜來看,‘熱科2號’所產(chǎn)沉香樣品(如圖1-S1、1-S2)的圖譜在保留時間25~35 min.出現(xiàn)了面積較小的色譜峰,而在保留時間39~44 min.出現(xiàn)了面積較大的色譜峰。前者主要被檢測為倍半萜,而后者主要被檢測為色酮化合物,具體成份詳見表1。從表1可知,‘熱科2 號’沉香樣品中鑒定的倍半萜和色酮相對百分含量之和平均分別為2.35%和93.18%,后者比前者明顯提高。其中被檢測到的倍半萜類化合物包括新紫蜂斗菜烯、枯樹醇、α-木香醇、4-羥基白木香醇、二氫卡拉酮、白木香醛、2,t-3-二甲基-2-(3-甲基-2-丁烯基)-1-環(huán)己酮、瓦倫薩-1(10),8-11-醇、7α-H-9(10)-烯-11,12-環(huán)氧-8-氧艾里莫芬烷、(-)-愈創(chuàng)木-1(10),11-二烯-15-醛、桉- 5.11(13)8.12 二烯內(nèi)酯、9-羥基-芹子-3,11-二烯-14-醛、11-羥基-瓦倫薩-1(l0)-烯-2-酮,等,這些倍半萜類化合物在白木香沉香中較為常見,在‘熱科2號’沉香樣品中的相對含量較低。
在‘熱科2號’所產(chǎn)沉香樣品中檢測到的色酮類化合物包括兩種類型:一種為5,6,7,8 位沒有取代基的色酮,相對含量較高,主要為2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮和2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮,這4個色酮相對含量之和為88.97%~98.51%,平均為93.16%,其中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的相對含量之和平均高達64.01%;另外一種類型為5,6,7,8 位有取代基的色酮,相對含量較低,包括6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮、6-羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基-4-甲氧基苯)乙基]色酮、6-甲氧基-7-羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮等,這部分色酮的相對含量較低(分別為0.5%以下)。與‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香樣品顯著不同,作為對照的普通白木香沉香樣品(圖1-S0)的GC-MS 分析的總離子流圖譜中,在保留時間20~35 min。出現(xiàn)了較多面積較大的色譜峰,而在保留時間42~45 min。出現(xiàn)了面積較少的色譜峰,前者主要被檢測為倍半萜,相對百分含量之和為49.6%,而后者主要被檢測為色酮化合物,其相對百分含量之和為5.02%,前者比后者明顯提高。其中被檢測到的倍半萜類化合物種類和與‘熱科2號’所產(chǎn)沉香樣品相差不大,但相對含量較‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香樣品顯著提高。相反,普通白木香沉香樣品中檢測到的色酮類化合物為5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮,種類少而且色酮的相對含量較低(5.02%)。因此,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香樣品的化學(xué)成份和對照的普通白木香沉香樣品有明顯差異。
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考察‘熱科2 號’17 個不同的沉香樣品GC-MS指紋圖譜的相似度(圖2),發(fā)現(xiàn)其數(shù)值很高。其中,S6 和其它樣品間為0.55~0.95,其它樣品在0.70~0.99(表2)。各樣品GC-MS指紋圖譜具有一個共同特征:即在保留時間39~44 min 出現(xiàn)了面積較大的4 個相同色譜峰。這4 個色譜峰被鑒定的相應(yīng)的化合物按保留時間先后順次分別為為2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮和2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮。這說明‘熱科2號’不同個體所產(chǎn)沉香樣品的化學(xué)成份具有較好的一致性,但同時這4種色酮在不同的樣品中的相對含量存在著不同程度的變化(圖3)。
各個樣品中相對含量最高而且最為穩(wěn)定的色酮是2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮(相對含量為29.49%~67.43%,平均為48.96%),其次為2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮(相對含量為7.11%~47.12%,平均為22.18%),2-(2-苯乙基)色酮(相對含量為0.60%~29.14%,平均為15.05%)和2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮(相對含量為1.17%~16.88%, 平均為6.97%)。因此,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分的分布有著顯著的特征。
表2 ‘熱科2號’不同沉香樣品GC-MS指紋圖譜相似度
從GC-MS 分析結(jié)果來看,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香包含的2-(2-苯乙基)色酮類化合物的相對含量較高,其主要特征性成份物質(zhì)為2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮和2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮,不同樣品化學(xué)成份的GC-MS指紋圖譜的相似度較高。這些數(shù)據(jù)說明該白木香品種所產(chǎn)沉香在化學(xué)成份方面具有明顯特征。
沉香的特征性化學(xué)成分,主要包括倍半萜和色酮類化合物。已從沉香中分離鑒定了136個倍半萜化合物結(jié)構(gòu)和128 個色酮類化合物的結(jié)構(gòu)[16]。倍半萜類化合物具有沉香呋喃類、桉葉烷類、艾里莫芬烷類、沉香螺烷類和愈創(chuàng)木烷類等多種結(jié)構(gòu)類型;2-(2-苯乙基)色酮類衍生物可分為5,6,7,8-二環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮、5,6-環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮、5,6,7,8-四氫-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮四種類型[16]。因此,沉香的化學(xué)成分種類非常豐富。從分析結(jié)果來看,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分以2-(2-苯乙基)色酮衍生物為主。不同類型的沉香,其化學(xué)成份的差異主要體現(xiàn)在倍半萜和色酮類化合物的相對含量以及具體的化合物組成方面。研究表明,不同白木香品種所產(chǎn)的沉香的化學(xué)成分大致存在3 種類型:一是包含較高的倍半萜,而色酮類化合物含量較低;二是包含的倍半萜和色酮類化合物含量相當(dāng);三是包含較低的倍半萜,而色酮類化合物含量較高[15]。除了這3 種類型外,還可能存在著中間類型。從分析結(jié)果來看,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香屬于第3 種類型。而“熱科1號”所產(chǎn)沉香屬于第二種類型[12]。
從海南、廣東、廣西、云南等地共取10 批白木香沉香樣品進行化學(xué)成分GC-MS 指紋圖譜分析[15],發(fā)現(xiàn)共有成份中,倍半萜主要為白木香醛、ent-4 (15) -eudesmen-11-ol-1-one、 11-hydroxy-valene-1(10)-en-2-one;色酮類化合物為2-(2-苯乙基)色酮、5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、5,8-二羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、6-羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮、6,7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮,除了2-(2-苯乙基)色酮外,都是5,6,7,8 位有取代的色酮?!疅峥? 號’所產(chǎn)沉香化學(xué)成分GC-MS 指紋圖譜的共有成份中,倍半萜主要為白木香醛,與前人的研究結(jié)果相似。而色酮類化合物主要為4種在5,6,7,8 位沒有取代的色酮,而且相對含量較高,成份較為集中,其分布與前人的研究結(jié)果有顯著的差異。這說明‘熱科2號’在所產(chǎn)沉香化學(xué)成分方面,與普通白木香不同,有突出的品種特征。
影響沉香化學(xué)成分多樣性的因素主要為品種的遺傳特性。白木香組織和細胞在受到物理、生物或化學(xué)等因子的傷害脅迫后才逐漸形成特征性化學(xué)成份[17-20]。其過程包括傷害信號的識別、傳導(dǎo)[21]和倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮類化合物合成相關(guān)基因的表達等[22-26]。倍半萜和色酮類是兩種結(jié)構(gòu)上差異較大的化合物,它們通過不同的代謝途徑合成。由于不同種質(zhì)的基因組成和表達調(diào)控的差異,導(dǎo)致最后形成的沉香的化學(xué)成份多樣性。‘熱科2 號’可能具有較突出的色酮類化合物的合成代謝通路的相關(guān)基因構(gòu)成,同時這些基因在受到物理、生物或化學(xué)等因子的傷害脅迫后獲得較高的表達,而目前的研究表明,一些普通白木香品種受到傷害脅迫后,主要為倍半萜合成代謝通路的相關(guān)基因上調(diào)表達[27],這為進一步研究白木香色酮類化合物的合成代謝通路提供了基礎(chǔ)。通過1~12 個月的動態(tài)研究表明,‘熱科2 號’ 樹種在受傷害誘導(dǎo)后倍半萜等合成較少,主要合成2- (2- 苯 乙 基) 色 酮(2- (2-phenylethyl)chromones,PECs)類化合物,同時環(huán)氧-2-(2-苯乙基) 色酮(PECs with epoxidated chromone moiety)的合成較少,推測2-(2-苯乙基)色酮生物合成是由III 型聚酮合成酶(PKSs) 催化介導(dǎo)[28]。
‘熱科2號’不同沉香樣品的化學(xué)成份的差異,主要表現(xiàn)在以上4種特征性成份物質(zhì)的相對含量存在較大的變化。因而,其GC-MS指紋圖譜存在一定的變化。由于在結(jié)香過程受到土壤因子、氣候因子、微生物等多種環(huán)境因素的影響,因而所形成的不同沉香樣品的化學(xué)成份有所差異。有研究表明,同一白木香樹桿因不同的結(jié)香方法形成的沉香的化學(xué)成份也可能存在差異[29]。因而,沉香的化學(xué)成分的形成除了受到遺傳因子的影響外,還受到環(huán)境因子的作用,但主成分決定于品種的遺傳屬性[30]。其中,2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的相對含量變化較小,說明它們受遺傳力的影響更大。
“奇楠”沉香和越南紅土沉香是目前業(yè)內(nèi)一致認可的優(yōu)質(zhì)天然沉香,研究表明這些沉香的乙醚萃取物中的2-(2-苯乙基)色酮類化合物的相對含量也較高,其中2-(2 苯乙基)色酮與2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮這2 個化合物的相對含量之和達51.57%~84.71%[31-33]?!疅峥? 號’所產(chǎn)沉香中2-(2-苯乙基)色酮與2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的相對含量之和平均為64.01%,說明其具有優(yōu)質(zhì)沉香的主要成份。但除了這2種色酮外,‘熱科2號’所產(chǎn)沉香的2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮和2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮的相對含量也較高,這說明其色酮種類更多,有別于傳統(tǒng)的“奇楠”沉香和越南紅土沉香。2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香中高沸點香氣成份,這些成份顯著提高沉香香氣的沉穩(wěn)性。研究還表明,2-(2-苯乙基)色酮類化合物受熱時,降解為芳香族化合物,對沉香在受熱時的發(fā)香時間長短、香氣組成和變化具有重大貢獻[34]。因此,‘熱科2 號’所產(chǎn)沉香在作為香料方面具有獨特性。另外,2-(2-苯乙基)色酮類衍生物具有不同程度的抗過敏和神經(jīng)保護方面的活性[34-35],推測‘熱科2號’所產(chǎn)沉香在抗過敏和神經(jīng)保護方面可能具有相對較好的活性,有待進一步研究。