支氣管肺泡灌洗液中輔助性T 淋巴細(xì)胞17 和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者臨床表型的相關(guān)性

李霞 榮慶娜 江麗娟 王歡

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以漸進(jìn)性氣流受限為特征的慢性持續(xù)性氣道炎癥性疾病，在臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征、病程發(fā)展、治療反應(yīng)等方面存在明顯的個(gè)體差異性[1]。 因此，單純依靠肺功能分級(jí)并不能完全反映患者的臨床狀態(tài)和異質(zhì)性。2010 年 Han 等[2]提出“COPD 表型”的概念，依據(jù)一系列可觀察且與臨床預(yù)后相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能特征對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療，包括影像學(xué)特征分型、病程時(shí)機(jī)分型、多維指標(biāo)分型等。 但由于COPD 表型分類眾多，且缺乏統(tǒng)一的分型標(biāo)準(zhǔn)，探討與表型相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要臨床意義。 輔助性T 淋巴細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞(Treg)免疫失衡是COPD 的重要發(fā)病機(jī)制之一[3]。 我們通過(guò)比較不同病程時(shí)期、肺功能分級(jí)、影像學(xué)表型的穩(wěn)定期COPD 患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中Th17 及 Treg 相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、干擾素(IFN)-γ 水平，旨在為協(xié)助診斷、指導(dǎo)個(gè)體化治療和及判斷預(yù)后提供參考。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選取2018 年7 月 ～2019 年5 月于我科就診的穩(wěn)定期COPD 患者52 例作為穩(wěn)定期COPD 組，同期于我院體檢的健康者50 例作為對(duì)照組。 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)COPD 患者符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013 年修訂版)》[4]關(guān)于COPD 的診斷和穩(wěn)定期的分期標(biāo)準(zhǔn)；(2)對(duì)照組受試者年齡、性別與COPD患者相匹配。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在纖維支氣管鏡檢查禁忌證；(2)標(biāo)本收集前1 個(gè)月有全身或呼吸道感染史；(3)合并活動(dòng)性肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺炎、肺癌、肺間質(zhì)纖維化等非COPD 肺部疾病；(4)合并惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、嚴(yán)重心腦血管疾病。 其中穩(wěn)定期 COPD 組男 32 例，女 20 例，年齡 43 ～ 80 歲，平均年齡(62.73 ±12.76)歲，BMI(23.58 ±2.81)kg/m2，有吸煙史者 20 例；對(duì)照組男 25 例，女 25 例，年齡 40 ～80 歲，平均年齡(63.46 ± 13.18)歲，BMI(24. 12 ± 3. 10)kg/m2，有吸煙史者18 例。兩組受試者年齡、性別、吸煙史較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。依據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》，采用過(guò)去1 年COPD 急性加重次數(shù)作為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，若＜2 次或因急性加重住院＜1 次則為低風(fēng)險(xiǎn)，若≥2 次或因急性加重住院≥1 次則為高風(fēng)險(xiǎn)；采用改良版英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)呼吸問(wèn)卷(mMRC)分級(jí)作為癥狀評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，＜2 級(jí)為癥狀輕，≥2 級(jí)為癥狀重。 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)和癥狀嚴(yán)重程度將52 例穩(wěn)定期 COPD 患者分為 4 組：A 組：低風(fēng)險(xiǎn)，癥狀輕，23 例；B 組：低風(fēng)險(xiǎn)，癥狀重，14 例；C 組：高風(fēng)險(xiǎn)，癥狀輕，9 例；D 組：高風(fēng)險(xiǎn)，癥狀重，6 例。 依據(jù)胸部高分辨率電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(HRCT)結(jié)果，將52 例穩(wěn)定期COPD 患者分為氣管炎型19 例、肺氣腫型17 例、混合型16 例。 根據(jù)慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)分級(jí)將52 例穩(wěn)定期 COPD 患者分為 GOLD 1 級(jí)12 例、GOLD 2 級(jí) 20 例、GOLD 3 級(jí) 14 例、GOLD 4 級(jí) 6 例。 本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)肺功能檢查：采用意大利科時(shí)邁PonyFX 型便攜式肺功能測(cè)試儀檢測(cè)穩(wěn)定期COPD 患者的肺功能，包括第1 秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)及FEV1/FVC。 每次測(cè)試均重復(fù)≥3 次，選取圖形最好的1 次作為最終結(jié)果。 根據(jù)FEV1占預(yù)測(cè)值的百分比(FEV1%pred)進(jìn)行GOLD 分級(jí)，GOLD 1 級(jí)：FEV1%pred ≥80%；GOLD 2 級(jí)：FEV1% pred 為 50% ～ 79%；GOLD 3 級(jí)：FEV1%pred 為 30% ～ 49% ；GOLD 4 級(jí)：FEV1%pred＜30%。

(2)BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測(cè)：經(jīng)纖維支氣管鏡采集兩組受試者肺段或肺亞段BALF，自活檢孔快速灌注20ml 生理鹽水，并立即負(fù)壓吸回灌洗液，重復(fù)5 ～6 次，總灌洗液量達(dá)100 ～120 ml，以1 500 r/min 離心10 min，取上清液，保存于-20 ℃冰箱中備用。 取血清復(fù)溶后，將待測(cè)樣本加入反應(yīng)板中，再加入 IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1、IFN-γ 抗體，反應(yīng)1 h 后終止，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 吸收波長(zhǎng)處的吸光度值。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 穩(wěn)定期COPD 組和對(duì)照組受試者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

表1 穩(wěn)定期COPD 組和對(duì)照組受試者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

組別 例數(shù) IL-17A(pg/ml) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml) TGF-β1(ng/ml) IFN-γ(ng/ml)對(duì)照組 50 15.38 ±7.30 29.53 ±12.47 19.27 ±3.64 2.97 ±1.45 4.55 ±1.79穩(wěn)定期 COPD 組 52 38.76 ±26.49 52.98 ±23.37 3.12 ±1.29 6.04 ±2.75 6.68 ±2.67 t 值 6.024 6.286 30.094 7.011 4.713 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 A、B、C、D 組穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

表2 A、B、C、D 組穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

注：與 A 組比較，aP ＜0.05；與 B 組比較，bP ＜0.05；與 C 組比較，cP ＜0.05

組別 例數(shù) IL-17A(pg/ml) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml) TGF-β1(ng/ml) IFN-γ(ng/ml)A 組 23 32.77 ± 19.56 46.74 ± 18.10 3.46 ± 1.08 5.50 ± 1.52 3.75 ± 1.50 B 組 14 35.82 ± 20.14 47.87 ± 18.95 3.13 ± 1.15 5.94 ± 1.73 4.17 ± 1.46 C 組 9 36.72 ± 15.85 50.28 ± 19.39 3.02 ± 0.99 6.12 ± 1.41 6.56 ± 1.28 D 組 6 57.59 ± 14.35abc 70.15 ± 12.62abc 1.87 ± 0.68abc 7.78 ± 1.19abc 7.98 ± 1.74abc F 值 2.845 2.794 3.659 3.539 18.109 P 值 0.047 0.050 0.019 0.021 ＜0.001

表3 不同胸部HRCT 分型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

表3 不同胸部HRCT 分型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

注：與氣管炎型比較，aP ＜0.05；與肺氣腫型比較，bP ＜0.05

組別 例數(shù) IL-17A(pg/mll) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml) TGF-β1(ng/ml) IFN-γ(ng/ml)氣管炎型 19 28.78 ±16.49 42.05 ±21.45 3.04 ±1.37 5.67 ±1.74 6.25 ±1.73肺氣腫型 17 34.82 ±13.15a 50.88 ±20.76a 2.71 ±1.29 5.92 ±2.13 6.38 ±2.11混合型 16 48.10 ±13.95ab 63.17 ±20.84ab 2.49 ±1.35 6.31 ±2.09 6.79 ±1.94 F 值 7.714 4.365 0.753 0.455 0.363 P 值 0.001 0.018 0.476 0.637 0.698

表4 不同GOLD 分級(jí)穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

表4 不同GOLD 分級(jí)穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

注：與 GOLD 1 級(jí)比較，aP ＜0.05；與 GOLD 2 級(jí)比較，bP ＜0.05；與 GOLD 3 級(jí)比較，cP ＜0.05

組別 例數(shù) IL-17A(pg/ml) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml) TGF-β1(ng/ml) IFN-γ(ng/ml)GOLD 1 級(jí) 12 27.95 ± 15.09 40.72 ± 16.76 3.50 ± 0.78 5.42 ± 1.63 2.78 ± 1.22 GOLD 2 級(jí) 20 39.73 ± 18.15a 49.40 ± 19.24a 3.13 ± 1.05a 6.40 ± 1.47a 4.42 ± 1.37a GOLD 3 級(jí) 14 47.24 ± 17.53ab 56.02 ± 16.60ab 2.82 ± 1.17ab 7.56 ± 1.76ab 7.10 ± 1.80ab GOLD 4 級(jí) 6 59.08 ± 11.10abc 63.29 ± 11.70abc 2.04 ± 0.70abc 8.43 ± 0.92abc 11.15 ± 3.28abc F 值 5.477 2.864 3.114 6.935 36.706 P 值 0.003 0.046 0.035 0.001 ＜0.001

結(jié) 果

1.穩(wěn)定期COPD 組和對(duì)照組受試者BALF 中 Th17 和Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平比較：穩(wěn)定期COPD 組患者BALF 中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IFN-γ 水平均高于對(duì)照組，IL-10 水平低于對(duì)照組(P＜0.05)。 見表 1。

2.A、B、C、D 組穩(wěn)定期 COPD 患者 BALF 中 Th17 和 Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較：D 組穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IFN-γ 水平均高于 A、B 及 C 組，IL-10 水平均低于A、B 和 C 組(P＜ 0.05)。 A、B、C 穩(wěn)定期 COPD 患者 BALF 中IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1及 IFN-γ 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見表 2。

3.不同胸部HRCT 分型穩(wěn)定期 COPD 患者 BALF 中Th17和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較：氣管炎型、肺氣腫型、混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而 3 組患者 BALF 中 IL-10、TGF-β1、IFN-γ 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 肺氣腫型和混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 水平均高于氣管炎型，混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 水平均高于肺氣腫型(P＜0.05)。 見表 3。

4. 不同 GOLD 分級(jí)穩(wěn)定期 COPD 患者 BALF 中 Th17 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較：隨著 GOLD 分級(jí)增高，穩(wěn)定期COPD 患者 BALF 中 IL-17A、IL-6、TGF-β1、IFN-γ 水平逐漸升高，而IL-10 水平逐漸降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 4。

討 論

持續(xù)性氣道炎癥反應(yīng)和氣流受限是COPD 的兩大基本特征，但不同患者的臨床表現(xiàn)、病情進(jìn)展、治療效果等均存在一定個(gè)體差異性，單純依靠肺功能檢查結(jié)果作為臨床治療的依據(jù)并不完全可靠。 由于COPD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前尚未找到能夠取代FEV1/FVC 成為疾病診斷、管理及預(yù)后評(píng)估更理想的指標(biāo)。

從已知的發(fā)病機(jī)制角度出發(fā)，COPD 屬于一類氣道慢性炎癥反應(yīng)性疾病，而這種炎癥反應(yīng)主要由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，因此有學(xué)者提出了COPD“自身免疫應(yīng)答”假說(shuō)[5]。 Treg 和Th17 是由初始T 淋巴細(xì)胞分化的兩大細(xì)胞亞群，二者相互遏制，共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的免疫平衡。 2005 年Harrington 等[6]和Park等[7]同時(shí)發(fā)現(xiàn)Th17 細(xì)胞亞群的存在，證實(shí)IL-17、IL-6 是其分泌的特征分子。 IL-17 是一種前炎癥細(xì)胞因子，主要由Th17 分泌，另外CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4-CD8-T 淋巴細(xì)胞等也可以少量分泌，其中臨床和文獻(xiàn)中檢測(cè)的IL-17 多為IL-17A[8]。IL-17A廣泛表達(dá)于呼吸道上皮細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)IL-6 的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，并參與氣道重構(gòu)。 本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)定期COPD組患者BALF 中IL-17A 和 IL-6 水平均高于對(duì)照組，推測(cè)Th17在COPD 發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。 凌燕君[9]的研究證實(shí) Th17 相關(guān)細(xì)胞因子 IL-23、IL-1β、IL-17A、IL-17F 均參與COPD 的發(fā)生和發(fā)展，且急性期各指標(biāo)水平與BODE 指數(shù)和GOLD 分級(jí)呈正相關(guān)。 汪露等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)，外周血Th17 水平及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-6 與COPD 患者的肺功能指標(biāo)有較好的相關(guān)性，在判斷預(yù)后方面具有一定的參考價(jià)值。 本研究中，隨著GOLD 分級(jí)增高，穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中 IL-17A、IL-6、TGF-β1、IFN-γ 水平逐漸升高，而 IL-10 水平逐漸降低，表明Th17 相關(guān)細(xì)胞因子水平在一定程度上反映了COPD 患者肺功能下降程度，考慮與IL-17A、IL-6 的促炎反應(yīng)機(jī)制有關(guān)，二者通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷，破壞支氣管結(jié)構(gòu)，加重肺功能惡化。

本研究中，肺氣腫型和混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 水平均高于氣管炎型，混合型穩(wěn)定期 COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 水平均高于肺氣腫型。 肺氣腫型、氣管炎型、混合型是臨床上COPD 最經(jīng)典的影像學(xué)分型，肺氣腫型患者主要表現(xiàn)為呼吸困難和運(yùn)動(dòng)耐量降低，且常伴過(guò)度通氣體征。Casanova 等[11]通過(guò)收集5 年的隨訪數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，肺氣腫型患者的肺功能和預(yù)后更差，且肺過(guò)度充氣程度與生存率呈負(fù)相關(guān)。O’Donnell等[12]發(fā)現(xiàn)肺氣腫型COPD 患者痰液中多數(shù)可分離出獨(dú)立潛在的病原微生物，且較非肺氣腫型患者合并癥的發(fā)生率更高。 有研究結(jié)果顯示，氣道病理變化、肺氣腫及氣流受限是相互獨(dú)立又彼此影響的3 個(gè)病理過(guò)程[13]。 與氣管炎型比較，肺氣腫型發(fā)病機(jī)制更復(fù)雜，慢性炎癥、氧化應(yīng)激、免疫失衡等均可能參與其中。 IL-17 是免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的交匯點(diǎn)，具有促進(jìn)炎癥和趨化免疫細(xì)胞的作用，可募集并誘導(dǎo)肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集、成熟和分化，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺實(shí)質(zhì)損傷，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。 這也解釋了本研究中肺氣腫型和混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中IL-17A、IL-6 水平均高于氣管炎型的原因。

除了Th17 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)外，Th17/Treg 免疫失衡也是COPD 發(fā)病的重要機(jī)制之一。 IL-10 屬于Treg 分化相關(guān)細(xì)胞因子，可促使初始T 淋巴細(xì)胞向Treg 分化，同時(shí)Treg 又可分泌IL-10，進(jìn)而抑制T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的病理性免疫應(yīng)答[14]。 而IL-6可抑制初始T 淋巴細(xì)胞向Treg 分化，甚至可促使已經(jīng)分化的Treg 向 Th17 細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 Th17 可通過(guò)分泌 IL-17A、IL-6 等促炎因子參與COPD 的發(fā)病機(jī)制，并抑制Treg 分化，而Treg 可通過(guò)免疫抑制和炎癥抑制作用降低有害物質(zhì)對(duì)肺組織的損傷。TGF-β1由氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等合成并分泌，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。 本研究中，穩(wěn)定期COPD 組患者BALF 中IL-10 低于對(duì)照組，TGF-β1和 IFN-γ 水平均高于對(duì)照組，而根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013 年修訂版)》分組的A、B、C 組穩(wěn)定期 COPD 患者 BALF 中 TGF-β1、IFN-γ 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且氣管炎型、肺氣腫型、混合型穩(wěn)定期COPD 患者BALF 中 IL-10、TGF-β1、IFN-γ 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Th17 和Trey 相關(guān)細(xì)胞因子可能并不能評(píng)估穩(wěn)定期COPD患者的預(yù)后相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)程度，且不能依據(jù)炎癥反應(yīng)程度鑒別肺氣腫型、氣管炎型、混合型穩(wěn)定期COPD 患者。

綜上所述，Th17 和Trey 相關(guān)因子與穩(wěn)定期COPD 患者的預(yù)后相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)程度的相關(guān)性不明顯，但Th17 相關(guān)因子可能可作為肺氣腫型穩(wěn)定期COPD 患者的異質(zhì)性標(biāo)志物，為臨床個(gè)體化治療提供一定的理論依據(jù)。