TGF-β1對(duì)口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞在二維和三維共培養(yǎng)條件下遷移的影響

楊津， 吳飛飛， 高慶紅， 李小玉， MANABU Kato， 程然， 周紅梅

1. 口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，四川成都（610041）； 2. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔頜面外科，四川 成都（610041）； 3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）； 4. 三重大學(xué)醫(yī)院腎內(nèi)科，日本 三重縣（514-8507）； 5.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院預(yù)防科，四川 成都（610041）

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最重要的間質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色［1-2］。本課題組前期研究結(jié)果顯示：與正常成纖維細(xì)胞相比，口腔CAFs 無(wú)論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)方式、分泌特性、染色體核型還是基因型等方面均發(fā)生了顯著變化，而正是這類(lèi)生物學(xué)特性異常活躍的CAFs 促進(jìn)了口腔癌的發(fā)生發(fā)展［3-5］。被募集遷移至癌巢區(qū)域是CAFs 重要的生物學(xué)特性之一［6-7］，但有關(guān)口腔CAFs 是否發(fā)生遷移，目前僅有本課題組前期在二維培養(yǎng)條件下觀察到的初步結(jié)果［8］。因二維細(xì)胞模型較難準(zhǔn)確模擬體內(nèi)環(huán)境［9］，因此，有必要建立三維細(xì)胞模型觀察CAFs 的遷移現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）對(duì)CAFs 的遷移調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本研究擬通過(guò)二維和三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型探討TGF-β1 對(duì)CAFs 遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

倒置熒光相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；青鏈霉素雙抗（HyClone，美國(guó)）；10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胰蛋白酶（HyClone，美國(guó)）；波形蛋白（vimentin）兔抗人單克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）兔抗人多克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒（索萊寶，中國(guó)）；polybrene（漢恒生物）。

1.2 標(biāo)本收集及口腔CAFs 原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

經(jīng)患者知情同意，選取2014～2016 年在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頜面外科收集的新鮮口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織塊。將組織置于含有青鏈霉素雙抗的PBS 緩沖液中備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。用青鏈霉素雙抗和PBS 沖洗組織塊，眼科剪剪切至1～3 mm3大小，均勻地排列在瓶底，相互距離約0.5 cm。10%胎牛血清高糖型DMEM 培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶底部，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待組織塊周?chē)莱龅募?xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底90%時(shí)，胰蛋白酶消化。傳代2 次純化CAFs。用第3 代純化細(xì)胞做鑒定。具體方法參照本課題組前期建立的組織塊法［10］。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定

細(xì)胞成單層鋪于蓋玻片上后，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞。PBS 漂洗后，用0.1%TritonX-100 處理細(xì)胞。采用生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。一抗包括波形蛋白（vimentin）兔抗人單克隆抗體、成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）兔抗人多克隆抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體和細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗體，PBS 作為陰性對(duì)照。于倒置相差顯微鏡下觀察，將胞質(zhì)中出現(xiàn)淡棕色或棕黃色顆粒判為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 二維培養(yǎng)：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組 未經(jīng)處理的CAFs 細(xì)胞為對(duì)照組，以培養(yǎng)基中加入10 ng/mL TGF-β1 刺激的CAFs 為實(shí)驗(yàn)組。

1.4.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6 孔板中接種1 × 106個(gè)CAFs 培養(yǎng)24 h 至鋪滿(mǎn)，饑餓24 h 后，用10 μL 的槍尖劃線3 條、沖洗；分別加入含10 ng/mL TGF-β1 的和不含TGF-β1 的無(wú)血清高糖型DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；分別取0 h、24 h、48 h 后觀察、采圖。

1.4.3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) Transwell 小室實(shí)驗(yàn)中，Transwell 下室加入500 μL 含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組下室中加入外源性刺激因子10 ng/mL TGF-β1；上室加入200 μL 密度為2 × 105個(gè)/mL 的CAFs 細(xì)胞混懸液。培養(yǎng)24 h 后，取出小室，沖洗，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，光鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.5 制備綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（+）CAFs

CAFs 細(xì)胞計(jì)數(shù)1.5×106個(gè)后培養(yǎng)24 h，換1 mL新鮮培養(yǎng)基和5 μg 的polybrene。每瓶中加入4.5× 107IU 慢病毒溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，慢病毒質(zhì)粒中插入GFP 片段和平陽(yáng)霉素抗性基因片段。培養(yǎng)24 h 后換為含10 ng/mL 平陽(yáng)霉素的新鮮培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP 的細(xì)胞，同時(shí)，向空白組的CAFs 中加入同等量的平陽(yáng)霉素，隔天換液培養(yǎng)。待空白組的CAFs 全部死亡后，將GFP（+）細(xì)胞培養(yǎng)液換為無(wú)平陽(yáng)霉素的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。

1.6 三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

借助GFP（+）CAFs 對(duì)現(xiàn)有的三維細(xì)胞遷移模型進(jìn)行改進(jìn)，建立了腫瘤細(xì)胞和CAFs 遷移的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型（圖1），該模型中，基質(zhì)膠上方為口腔癌細(xì)胞株SCC25，基質(zhì)膠分為上下層，上層為GFP 標(biāo)記的CAFs，下層為無(wú)標(biāo)記的CAFs，以方便觀察上層CAFs 向下層的遷移。

Figure 1 Establishment of a three-dimensional culture model for the migration of CAFs and squamous carcinoma cells. Created with BioRender.com圖1 建立腫瘤細(xì)胞和CAFs 遷移的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型

三維培養(yǎng)體系基質(zhì)成分按照表1 的比例混合，放于冰上備用，制備為組織基質(zhì)。吸取CAFs 與上述配制的基質(zhì)混勻，取100 μL（細(xì)胞數(shù)5 × 105個(gè)/mL）加入96 孔板中，置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育0.5 h，待基質(zhì)凝固，制備為下層間質(zhì)組織；GFP（+）CAFs 與基質(zhì)混勻，取100 μL（細(xì)胞數(shù)5 × 105個(gè)/mL）加入96 孔板中基質(zhì)的上層，37 ℃，5%CO2孵箱孵育0.5 h 后，制備為上層間質(zhì)組織，加入100 μL培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。在制備好的間質(zhì)組織上種植腫瘤細(xì)胞，吸取SCC25 細(xì)胞混懸液100 μL（細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)/mL）加入96 孔板中，培養(yǎng)24 h。

表1 三維培養(yǎng)體系基質(zhì)成分Table 1 Proportion of gel components

用I型膠原浸泡尼龍膜，置于孵箱中孵育30 min后，用含1%戊二醛的PBS 固定［11］，置于4 ℃冰箱中1 h 后PBS 和培養(yǎng)基交替沖洗，浸泡于培養(yǎng)基中，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，制備尼龍膜。取?6 孔板中已凝結(jié)成組織塊的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型放至培養(yǎng)皿尼龍膜上，浸泡含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 周。隔天換液。實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基中加入外源性10 ng/mL TGF-β1，對(duì)照組中不加入TGF-β1，以比較TGF-β1 對(duì)口腔癌細(xì)胞和CAFs 細(xì)胞遷移的影響。培養(yǎng)1 周后4%多聚甲醛固定24 h，脫水機(jī)中脫水，液體蠟包埋后切片。組織切片行HE 染色：將組織切片放入二甲苯中脫蠟，然后置于梯度酒精中進(jìn)行水化，于蘇木素染液中染色水洗，1%鹽酸酒精分色，置于伊紅染液中染色，梯度酒精脫水，置于二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片。分別置于普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察采圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的K-S 檢驗(yàn)方法對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)資料服從正分布，則采用studentt檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)資料不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CAFs 的原代培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)的CAFs 5 d 可見(jiàn)組織塊周?chē)猩倭考?xì)胞爬出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。原代培養(yǎng)的3 株細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白表達(dá)均呈陰性，波形蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于間質(zhì)，而非來(lái)源于上皮。

α-SMA 和FAP 常作為鑒定CAFs 的標(biāo)志蛋白，染色陽(yáng)性表達(dá)（圖2），說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為CAFs［12］。

Figure 2 Immunocytochemistry staining to identify CAFs ×40圖2 CAFs 免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性結(jié)果 ×40

2.2 二維培養(yǎng)培養(yǎng)條件下口腔CAFs 的遷移

2.2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在對(duì)照組中，24 h 時(shí)可觀察到細(xì)胞的遷移，48 h 細(xì)胞遷移數(shù)增多，劃痕寬度變??；在實(shí)驗(yàn)組中，24 h 時(shí)細(xì)胞遷移數(shù)較對(duì)照組多，48 h 時(shí)劃痕基本愈合（圖3a）；24 h（t=3.595，P=0.023）和48 h 時(shí)（t=19.24，P＜0.001，圖3b），兩組間的平均劃痕寬度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)中觀察到了CAFs 的遷移現(xiàn)象，加入外源性TGFβ1 刺激因子24 h 后，實(shí)驗(yàn)組中平均細(xì)胞遷移數(shù)達(dá)到122 個(gè)，而對(duì)照組平均細(xì)胞遷移數(shù)59.33 個(gè)，實(shí)驗(yàn)組明顯較對(duì)照組增多（圖3c、3d）。兩組間的平均細(xì)胞遷移數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.132，P=0.001，圖3e）。

2.3 三維細(xì)胞培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞和CAFs 遷移的觀察

用慢病毒轉(zhuǎn)染制備的GFP（+）CAFs，慢病毒轉(zhuǎn)染率達(dá)到了90%以上。借助GFP（+）CAFs 建立了腫瘤細(xì)胞和CAFs 遷移的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通光鏡下可發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤上皮層和細(xì)胞間質(zhì)層，腫瘤上皮細(xì)胞向間質(zhì)明顯浸潤(rùn)（圖4a）；在熒光顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)圖中GFP（+）的CAFs 分布在基質(zhì)膠的全層中，即整個(gè)間質(zhì)層中可觀察到GFP 標(biāo)記的CAFs，提示GFP（+）的CAFs 向下層膠中發(fā)生了遷移（圖4b）。

Figure 3 Comparison of the two-dimensional cell culture model formigration between the two groups圖3 兩組間二維細(xì)胞培養(yǎng)遷移結(jié)果的比較

Figure 4 Observation of the three-dimensional culture model for migration圖4 三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型的遷移結(jié)果觀察

在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入TGF-β1，HE 染色后，進(jìn)行比較（圖5a），結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組平均浸潤(rùn)深度/三維細(xì)胞培養(yǎng)組織全層深度的比值約0.436，對(duì)照組約0.433，兩組間腫瘤細(xì)胞平均浸潤(rùn)深度比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.03，P=0.977，圖5b）；熒光成像比較GFP（+）CAFs在間質(zhì)層的遷移，發(fā)現(xiàn)GFP（+）CAFs已遷移至未標(biāo)記CAFs 細(xì)胞層（圖5c），且10 ng/mL TGF-β1對(duì)CAFs細(xì)胞遷移深度也無(wú)明顯影響。

3 討 論

Figure 5 Comparison of the three-dimensional cell culture model for migration between two groups圖5 兩組間三維細(xì)胞培養(yǎng)遷移結(jié)果的比較

目前CAFs 研究大多采用二維模型，即劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)［5-6，13］。二維培養(yǎng)條件較難模擬體內(nèi)環(huán)境，缺乏與腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞間基質(zhì)的相互作用，與體內(nèi)CAFs 真實(shí)生存環(huán)境有一定差異［14］。為了能更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，研究者們模擬出三維共培養(yǎng)模型［15-16］，Horie 等［17］通過(guò)建立上皮細(xì)胞-CAFs 三維共培養(yǎng)模型，用以研究肺癌細(xì)胞與CAFs 間的作用，在組織培養(yǎng)5 d 后，組織切片后可看到上皮細(xì)胞的浸潤(rùn)。Ham 等［9］通過(guò)三維基質(zhì)-三陰性乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)，方便地模擬CAFs 與三陰性乳腺癌細(xì)胞的相互作用，量化其對(duì)癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和耐藥的影響。Bertero 等［11］應(yīng)用了由成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞集體侵襲的三維模型。Nakamura 等［18］利用三維培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)平足蛋白（+）CAFs 對(duì)肺腺癌腫瘤細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用。三維模型與Transwell 小室等其他共培養(yǎng)體系相比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀，且更接近真實(shí)環(huán)境［19］。課題組對(duì)現(xiàn)有的三維共細(xì)胞遷移模型進(jìn)行了改進(jìn)，以更直觀地觀察口腔CAFs 的遷移現(xiàn)象。三維培養(yǎng)通過(guò)腫瘤上皮層和基質(zhì)層的建立，能模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，研究腫瘤細(xì)胞與CAFs 間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)基質(zhì)分層、上層細(xì)胞標(biāo)記后，可以更加直觀地觀察到CAFs 的遷移。

TGF-β1 作為腫瘤細(xì)胞和CAFs 之間相互作用的重要細(xì)胞因子［20-21］，既可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［22］，也可加強(qiáng)CAFs 的遷移能力。在TGF-β1 調(diào)控下，結(jié)腸癌CAFs 中的連接蛋白claudin-11 表達(dá)上調(diào)，可促使CAFs 集中遷移［23］。旁分泌的TGF-β1 在CAFs 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用［22］。并且TGF-β1 的相互旁分泌作用可增強(qiáng)CAFs 誘導(dǎo)的癌細(xì)胞侵襲［6-7］。本實(shí)驗(yàn)在二維培養(yǎng)條件下，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell 小室實(shí)驗(yàn)觀察到了CAFs 的遷移現(xiàn)象，并證實(shí)了TGF-β1 可促進(jìn)CAFs 的遷移。但三維共培養(yǎng)模型中，未發(fā)現(xiàn)TGFβ1 對(duì)腫瘤細(xì)胞和CAFs 遷移的明顯影響。二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)需要的TGF-β1 的濃度有差異，三維共培養(yǎng)模式下梯度滲透［16］后，細(xì)胞直接接觸的TGF-β1 濃度相較于二維培養(yǎng)接觸的濃度低，不同的培養(yǎng)方式提示TGF-β1 對(duì)細(xì)胞遷移的效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明二維培養(yǎng)模擬體內(nèi)具有局限性，三維培養(yǎng)更接近于真實(shí)情況，TGF-β1在真實(shí)的腫瘤微環(huán)境中對(duì)CAFs 遷移是否起到作用，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，使用腫瘤細(xì)胞、CAFs 以及膠原建立的三維模型能良好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的組成、結(jié)構(gòu)和形態(tài)，可以更好地模擬腫瘤微環(huán)境，模擬體內(nèi)環(huán)境下CAFs 的遷移。三維模型為研究腫瘤微環(huán)境中各組分的相關(guān)關(guān)系［24］，模擬細(xì)胞遷移、細(xì)胞生物力學(xué)［25］、腫瘤細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)［26］、藥物干預(yù)等［27］提供了實(shí)驗(yàn)條件。