礬根組織培養(yǎng)離體快繁生根體系的建立

張 慧，羅珍珍，孫紀(jì)霞，解曉旭，孫印兵，于文勝*

（1.煙臺(tái)市園林建設(shè)養(yǎng)護(hù)中心，山東 煙臺(tái)264000；2.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái)265500）

礬根（Heuchera micrantha），為虎耳草科礬根屬多年生草本花卉。原產(chǎn)美洲中部，耐寒性強(qiáng)，適宜在我國(guó)北方生長(zhǎng)。礬根品種繁多，葉色豐富，能耐受-34℃低溫，是用于秋冬季節(jié)露地栽植的優(yōu)良彩葉植物品種，極具觀賞價(jià)值，可作陽(yáng)臺(tái)、庭院綠化，也可作為林下花境、地被植物，近年來(lái)頗受青睞，市場(chǎng)需求量很大[1]。

目前，礬根的繁殖方式有播種、葉插、分株和組培等方式[2]。礬根種子細(xì)小，出芽率低，種子繁殖發(fā)芽慢；葉插方式受季節(jié)限制，繁殖系數(shù)低；因礬根生長(zhǎng)點(diǎn)低，不易分株，分株繁殖取材困難，繁殖速度慢，這些繁殖方式都難以滿足市場(chǎng)需求。組培快繁可以在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)無(wú)菌種苗，高效快速、性狀一致，是解決種苗短缺的有效方法[3]。近年來(lái)，組培繁殖逐漸成為礬根繁殖的主要途徑。

在礬根的離體快繁中，生根培養(yǎng)至關(guān)重要，生根率、根系健壯程度都直接影響到移栽成活率。已有報(bào)道中，主要研究了激素濃度及配比對(duì)于生根的影響，如孫翊[4]、章志紅等[5]分別研究了不同NAA 濃度對(duì)‘紫色宮殿’、美洲礬根生根的影響，束曉春[6]、陸錦明[7]、田莉等[8]研究了不同IBA 對(duì)‘花毯’、‘紅貝露’、‘巴黎’等品種生根的影響，李川等[9]研究了6-BA 和NAA 濃度對(duì)不同品種礬根生根的影響。本研究從外源激素濃度、基本離子濃度以及碳源蔗糖、附加物活性炭濃度等4 個(gè)方面對(duì)‘巴黎’的組培生根進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了完善的生根體系，解決了生根苗細(xì)弱、成活率低等難題，將組培生根和移栽定植有力銜接，大大提高了移栽成活率。同時(shí)探討了培養(yǎng)基及附加物的用量問(wèn)題，旨在節(jié)約成本，提高產(chǎn)出，為礬根的組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料取自煙臺(tái)園林建設(shè)養(yǎng)護(hù)中心科研所溫室，是2017年自威海七彩生物科技有限公司引進(jìn)的‘巴黎’（Heuchera micrantha‘Paris’）品種礬根，經(jīng)過(guò)初代愈傷組織誘導(dǎo)及繼代增殖離體培養(yǎng)，生成再生植株，取單株組培苗接種，進(jìn)行生根體系的建立。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)使用MS 培養(yǎng)基，添加瓊脂粉5.8 g/L，肌醇、酪蛋白各100 mg/L，pH 值為5.8，121℃/ 20 min高壓滅菌。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為25±1℃，相對(duì)濕度保持在70-75%。試驗(yàn)設(shè)置如下：

①基本培養(yǎng)基對(duì)生根的影響：分別設(shè)MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4 種不同的基本離子濃度，添加NAA 0.2 mg/L，蔗糖8 g/L，活性炭1.0 mg/L。

②NAA 濃度對(duì)生根的影響：1/2MS 培養(yǎng)基添加蔗糖8 g/L，活性炭1.0 mg/L，NAA 濃度分別設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6 mg/L。

③蔗糖濃度對(duì)生根的影響：首先設(shè)10、20、30、40 g/L 4 個(gè)不同的蔗糖濃度，為研究低濃度蔗糖的生根情況，進(jìn)一步設(shè)置6.0、8.0、10.0、12.0 g/L 4 個(gè)濃度進(jìn)行研究，1/2MS 培養(yǎng)基添加NAA 0.2 mg/L，活性炭1.0 mg/L。

④活性炭濃度對(duì)生根的影響：1/2MS 培養(yǎng)基添加NAA 0.2 mg/L，蔗糖8 mg/L?；钚蕴繚舛确謩e設(shè)置為0（ck）、1.0、2.0、3.0 g/L。

上述試驗(yàn)條件下，每瓶培養(yǎng)基接種4 株苗，接種20 瓶，3 次重復(fù)，培養(yǎng)20 d 后，統(tǒng)計(jì)生根率，單株生根數(shù)，株高及苗的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。（大部分組培苗在15 d 左右開(kāi)始生根，為了讓數(shù)據(jù)更加統(tǒng)一，選擇20 d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。）

表1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)‘巴黎’生根的影響

生根率=生根的植株數(shù)/接種的植株總數(shù)

單株生根數(shù)=接種的每株苗生出的根數(shù)

生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)=苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，量化為1-5 五個(gè)級(jí)別（最佳為5，最差為1）

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用LSD、Duncan、SNK 等方法檢測(cè)各處理組間試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

通過(guò)多重比較顯示，基本培養(yǎng)基的變化對(duì)于‘巴黎’組培苗生根各項(xiàng)指標(biāo)的影響，呈現(xiàn)顯著性差異（表1）。在1/2MS 培養(yǎng)基中，生根率最高，達(dá)到98.65%，單株平均生根數(shù)最多，為6.46 條，生根苗的總體生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最好，這些都與其他基本培養(yǎng)基存在顯著性差異。株高在MS 培養(yǎng)基中生根率最好，此培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素較豐富，可能是導(dǎo)致株高相對(duì)高的原因，但株高并不是體現(xiàn)生根狀況的關(guān)鍵因素，生根的情況以及總體的生長(zhǎng)狀態(tài)是衡量生根的關(guān)鍵指標(biāo)。另外，在除1/2MS 培養(yǎng)基外的其他培養(yǎng)基中，各指標(biāo)未呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。綜上可得，‘巴黎’組培苗生根的最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS。

2.2 不同NAA 濃度對(duì)生根的影響

NAA 濃度對(duì)‘巴黎’組培苗生根的影響見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，NAA 濃度為0.2 時(shí)，生根率為97.56%，單株平均生根數(shù)為5.14 條，生長(zhǎng)總體態(tài)勢(shì)為4.11，均高于其他濃度，且存在顯著性差異。株高為2.61 cm，也是最高的，但與其他濃度不存在顯著性差異。其他濃度下，生根率、單株根數(shù)都高于未添加NAA的培養(yǎng)基，由此可見(jiàn)，添加NAA 對(duì)生根起到了促進(jìn)作用，最佳濃度為0.2 mg/L。

表2 不同NAA 濃度對(duì)‘巴黎’生根的影響

由表2可知，在不添加NAA 的培養(yǎng)基中，生根率也達(dá)到了84.6%，但添加0.2 mg/L 的NAA 后，生根率得到了明顯提升，可以看出，添加NAA 對(duì)生根起到了促進(jìn)作用，但并非添加濃度越高，生根率越高，只需少量添加即可達(dá)到促進(jìn)生根的效果。

2.3 不同蔗糖濃度對(duì)生根的影響

由表3及圖1可見(jiàn)，蔗糖濃度為10 g/L 時(shí)，生根率為96.60%，單株平均生根數(shù)為8.3 條，生長(zhǎng)總體態(tài)勢(shì)為4.0，均高于其他濃度，且存在顯著性差異。此濃度下株高為2.8 cm，也是各濃度中最高，但不存在顯著性差異。由此可見(jiàn)蔗糖添加量為10 g/L時(shí)生根狀況最好，為研究是否可添加更少量的蔗糖，能達(dá)到更好的生根效果，進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

表3 不同蔗糖濃度對(duì)‘巴黎’生根的影響

低濃度蔗糖下，‘巴黎’ 整體生根情況如見(jiàn)表4及圖2，可見(jiàn)蔗糖濃度為8 g/L 時(shí)，生根效果最好，此時(shí)生根率、生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)都是最好的，分別為97.09%和4.51，與其他濃度存在顯著性差異。株高在蔗糖濃度為12 g/L 時(shí)最高為3.9 cm，可能因?yàn)闈舛认鄬?duì)高的蔗糖作為碳源，為植株提供了較為充足的能量。綜合來(lái)看，選擇8 g/L 蔗糖即可達(dá)到較好的生根效果。

表4 低濃度蔗糖對(duì)‘巴黎’生根的影響

圖1 不同蔗糖濃度對(duì)生根率的影響

圖2 低濃度蔗糖對(duì)生根率的影響

2.4 不同活性炭濃度對(duì)生根的影響

由表5可見(jiàn)，活性炭濃度為1.0 g/L 時(shí)，生根率最高，為98.11%，與其他組不存在顯著性差異，單株生根數(shù)為5.12 條，株高為3.38 cm，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)4.44，都是最高的，并且與其他組存在顯著性差異，活性炭濃度為2.0 時(shí)，也表現(xiàn)出了較好的生根效果，但綜合來(lái)看，為節(jié)約成本，節(jié)省用量，生產(chǎn)中‘巴黎’生根選擇1.0 g/L 的活性炭即可。

表5 不同活性炭濃度對(duì)‘巴黎’生根的影響

2.5 組培苗的煉苗及移栽

生根組培苗，移入溫室，不開(kāi)蓋煉苗2 d，開(kāi)蓋煉苗2 d，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，以進(jìn)口草炭土：珍珠巖3:1 作為基質(zhì)，進(jìn)行移栽，成活率可達(dá)95%以上。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以‘巴黎’品種礬根的組培苗作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行生根體系的研究，結(jié)果表明：促進(jìn)單株組培苗生根的最佳NAA 濃度為0.2 mg/L，最適宜蔗糖濃度為8 g/L，活性炭濃度為1.0 g/L，在此生根配方下，生根率最高可達(dá)98%，單株平均生根數(shù)達(dá)6 條，株高可達(dá)3.8 cm，植株健壯，呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，移栽成活率高，可達(dá)95%。

本研究重點(diǎn)探索培養(yǎng)基及附加物的低濃度添加，采用1/2MS 基本培養(yǎng)基，低濃度NAA、蔗糖及活性炭，既保證了組培苗的生根效果，提高了移栽的成活率，也降低了用量，節(jié)省了成本。對(duì)于基本培養(yǎng)基，生根對(duì)大量元素的需求低，可以減少大量元素的用量，在已有研究中，除礬根‘花毯’以MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基外[6]，大部分研究采用了1/2MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[7-9]，但大多未進(jìn)行詳細(xì)探討。本研究設(shè)置了不同的基本離子濃度，進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基生根率最高，但1/3MS 的生根表現(xiàn)也不錯(cuò)，二者不存在顯著性差異，故在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，為節(jié)省成本，也可以作為選擇。

對(duì)于礬根生根所需糖量，本研究進(jìn)行了詳細(xì)探索，根據(jù)以往試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，設(shè)置了10、20、30、40 g/L4個(gè)不同的濃度梯度，但經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為10 g/L 時(shí)，生根狀況最好。為探索最佳糖類添加量，探討低糖生根培養(yǎng)的可能性，進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)低糖情況下生根狀況較好，（也進(jìn)行了無(wú)糖生根培養(yǎng)預(yù)試驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)無(wú)糖情況下，生根及生長(zhǎng)狀況不佳），盡量減少糖的用量，在蔗糖添加量為8 g/L時(shí)，生根狀況最好。王小輝等[10]也進(jìn)行了礬根低糖生根研究，蔗糖濃度為8-12 g/L，另外，低糖生根培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，碳源逐漸消耗，能量不充足，影響了整個(gè)植株的生長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)弱、黃化?！屠琛?大概15 d 左右生根，20～25 d 左右根長(zhǎng)及長(zhǎng)勢(shì)達(dá)到最佳，即可煉苗栽植。低糖培養(yǎng)在一定程度上縮短了生根周期，節(jié)約了成本，利于產(chǎn)業(yè)化周年生產(chǎn)。

對(duì)于生根培養(yǎng)基中添加活性炭（AC）的研究較少，蒲春林等[11]以1/2MS+ 0.2 mg/L NAA+0.5 g/L AC為培養(yǎng)基進(jìn)行礬根生根培養(yǎng)，生根率達(dá)95%，本研究采用1.0 g/L AC，生根率達(dá)到了98%。

組培離體快繁過(guò)程中，因?yàn)橹参锓N類及基因型的不同，對(duì)于添加物的需求存在著很大差異，進(jìn)行針對(duì)性分析研究是非常必要的。另外，組培行業(yè)技術(shù)要求高，設(shè)備藥品成本高，成為限制其發(fā)展的重要因素，本研究建立了高效集約的生根體系，提高了生根率和移栽成活率，對(duì)于控制產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)出有積極的意義。