棉花角斑病菌V8高效電轉(zhuǎn)化條件的探索

王清 孟凡奇 張勇躍 繆衛(wèi)國 劉志堅(jiān)

摘要：對去甲基化氮胞苷（5-AZA）的最佳濃度以及影響棉花角斑病菌[Xanthmonas campestris pv.malvacearum （Xcm） lV8電轉(zhuǎn)化效率的諸多因素進(jìn)行逐一研究，以期獲得高效的電轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明，選取100 limol/L的5-AZA馴化處于對數(shù)中期的V8制備感受態(tài)細(xì)胞;保證電壓2.1 kV、50 μg/mL質(zhì)粒7μL、4℃預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基SOC、振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)4-5 h時，V8的電轉(zhuǎn)化效率高達(dá)5×10²/μg DNA。

關(guān)鍵詞：棉花角斑病菌[Xanthmona scampestris pv.malvacearum （Xcm） ]V8;菌株馴化;電轉(zhuǎn)化條件;電轉(zhuǎn)化效率

中圖分類號：Q78;S435.621.2+5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020）12-0175-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.12.039

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

在中國，棉花是重要性僅次于糧食的作物，棉花細(xì)菌性角斑病是多數(shù)棉花種植區(qū)重要的細(xì)菌病害之一，對棉花整個生產(chǎn)過程造成了較大的負(fù)面影響[1]。該病菌的病原是野油菜黃單胞菌錦葵致病變種[Xanthmonas campestrispv. malvacearum （Xcm）][2]。黃單胞菌屬是植物病原菌中較大的類群[3]，隨著細(xì)菌基因組學(xué)的發(fā)展，主要致病菌的hrp基因功能[4]等研究也更加深入。限制性修飾系統(tǒng)能抑制細(xì)菌基因組外來DNA交換引起的變化，降解異源DNA進(jìn)而保護(hù)細(xì)菌[5]，導(dǎo)致Xcm的8號小種V8電轉(zhuǎn)化效率為零，推測這可能是hpaXm及hpaXm-IP基因通過電轉(zhuǎn)化而定點(diǎn)敲除失敗的原因。

通過去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化野生菌株[ 5]，突破了V8電轉(zhuǎn)化效率為0的限制，成功對V8進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，并證實(shí)5-AZA使用濃度在100 μmol/L時馴化菌株最高效。以從V8基因組中克隆出的基因hpaXm及其信號肽類似序列hpaXm-IP為靶標(biāo)基因，以前期構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762為待轉(zhuǎn)質(zhì)粒，對影響V8電轉(zhuǎn)化的一系列因素，如細(xì)胞生長狀態(tài)、電壓強(qiáng)度、質(zhì)粒濃度及用量、復(fù)蘇方式及時間、復(fù)蘇培養(yǎng)基種類及溫度等進(jìn)行分析，為后續(xù)V8其他基因的定點(diǎn)敲除提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為棉花角斑病菌V8，從棉花上分離。質(zhì)粒為pK18mobsacB：： N1012及pK18mobsacB：： m762，前期構(gòu)建。主要溶液為去甲基化氮胞苷溶液。

1.2 方法

菌株馴化參考李崗[5]的方法。

1.3突變菌株V8△hpaXm和V8△hpaXm-lP的獲得

電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，具體驗(yàn)證參考王清等[6]的方法。

1.4去甲基化氮胞苷馴化V8的濃度篩選

采用去甲基化氮胞苷馴化V8，將V8電轉(zhuǎn)化的條件及各參數(shù)基本保持一致，具體為采用對數(shù)期V8制備感受態(tài)、電壓2.5 kV、振蕩復(fù)蘇3h、常溫復(fù)蘇培養(yǎng)基NB等，篩選5-AZA的最佳使用濃度。

1.5 不同條件對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響

將每個可能影響電轉(zhuǎn)化效率的因素當(dāng)作1個處理，每個處理3次重復(fù)，電轉(zhuǎn)化后置于28℃恒溫培養(yǎng)約4d，計(jì)算電轉(zhuǎn)化效率。電轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/μg DNA;轉(zhuǎn)化子數(shù)目=單菌落數(shù)×轉(zhuǎn)化原液總體積×稀釋倍數(shù)/涂板菌液體積[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1不同濃度的去甲基化氮胞苷對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響

由于在用去甲基化氮胞苷馴化V8菌株之前，不清楚使V8菌株轉(zhuǎn)化效率最高的5-AZA濃度，故配制了l mmol/L的母液，采用逐代馴化的模式，摸索出V8電轉(zhuǎn)化效率與5-AZA濃度的關(guān)系。當(dāng)5-AZA濃度大于20 μmol/L時，開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，直至5-AZA濃度達(dá)100 μmol/L時，V8菌株的電轉(zhuǎn)化效率相對較高，約為4.5x10²/μ DNA，隨后繼續(xù)提高5-AZA的篩選壓力，V8菌株的轉(zhuǎn)化效率有所下降，說明100 μmol/L左右的5-AZA篩選的限制修飾系統(tǒng)突變菌株V8比較適合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化（圖1）。

2. 電轉(zhuǎn)化中各因素對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響

由“2.1”試驗(yàn)結(jié)果可知，選取去甲基化氮胞苷處理菌株的方式，完成對V8的馴化，以此處理的菌株作為制備后續(xù)電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，并以此對電轉(zhuǎn)化中涉及的各因素進(jìn)行逐個研究。

2.2.1 細(xì)菌生長狀態(tài)對V8菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響V8培養(yǎng)到34 h左右，電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，此時對應(yīng)的菌液OD600mm為0.6左右，說明對數(shù)中期的V8生長旺盛，種群數(shù)量多，菌體粗壯，適合制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞（圖2）。

2.2.2 電場強(qiáng)度對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響 在電壓小于2.1 kV時，電壓與V8的電轉(zhuǎn)化效率呈正相關(guān)，此時V8對外源質(zhì)粒的吸收能力隨電壓強(qiáng)度增強(qiáng)而變大;但當(dāng)電壓超過2.1 kV后，二者之間的關(guān)系由正相關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)，甚至在電壓達(dá)2.7 kV時，由于過高的電壓會導(dǎo)致感受態(tài)細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化效率降為0。說明2.1 kV是適合V8電轉(zhuǎn)化的最佳電壓，此時電轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.5x10²/μgDNA（圖3）。

2.2.3 質(zhì)粒濃度對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響 質(zhì)粒濃度與電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系呈正相關(guān)，但無限制的提高質(zhì)粒濃度，會出現(xiàn)電轉(zhuǎn)化杯的“爆杯”，因此，為保證試驗(yàn)安全，質(zhì)粒濃度維持在（50+10） μg/mL，可保證V8電轉(zhuǎn)化效率約2.4x10²/μg DNA（圖4）。

2.2.4質(zhì)粒用量對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響 在質(zhì)粒用量小于或等于7μL時，質(zhì)粒量與電轉(zhuǎn)化效率呈正相關(guān)，隨著質(zhì)粒量的提高，電轉(zhuǎn)化效率逐漸升高;但當(dāng)質(zhì)粒量超過7μL時，二者之間的關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)。表明7 μL的質(zhì)粒即可以使V8獲得3.1x10²/μg DNA的電轉(zhuǎn)化效率（圖5）。

2.2.5復(fù)蘇培養(yǎng)基種類對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響SOC作為復(fù)蘇培養(yǎng)基時，V8電轉(zhuǎn)化效率最高，其次是NA，二者作為復(fù)蘇培養(yǎng)基的電轉(zhuǎn)化效率是LB的200倍左右。說明SOC和NA相對適合作為V8電轉(zhuǎn)化復(fù)蘇培養(yǎng)基（圖6）。

2.2.6復(fù)蘇培養(yǎng)基溫度對V8菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響 4℃預(yù)冷SOC的轉(zhuǎn)化效率約是常溫復(fù)蘇培養(yǎng)基電轉(zhuǎn)化效率的1.5倍。說明預(yù)冷的SOC是V8電轉(zhuǎn)化時適合受傷感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)活力的培養(yǎng)基（圖7）。

2.2.7復(fù)蘇方式對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響 采用在電擊結(jié)束后對感受態(tài)細(xì)胞不復(fù)蘇培養(yǎng)直接涂板、3h的靜置復(fù)蘇培養(yǎng)和振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)的3種復(fù)蘇方式，不同復(fù)蘇方式使V8電轉(zhuǎn)化效率差異明顯。由圖8可以看出，感受態(tài)細(xì)胞不復(fù)蘇培養(yǎng)后電轉(zhuǎn)化效率為0，感受態(tài)細(xì)胞靜置復(fù)蘇培養(yǎng)后也幾乎沒有轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。相反，振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞可使V8電轉(zhuǎn)化效率提高350倍左右。說明振蕩培養(yǎng)使V8受傷的細(xì)胞在有限時間內(nèi)盡可能地接觸復(fù)蘇培養(yǎng)液，通過降低細(xì)胞死亡率而提高電轉(zhuǎn)化效率。

2.2.8復(fù)蘇時間對V8電轉(zhuǎn)化效率的影響5h是感受態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇時間與轉(zhuǎn)化效率關(guān)系的分界點(diǎn)，在此之前V8的電轉(zhuǎn)化效率與復(fù)蘇時間呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)4.Ox10²/μg DNA;過長的復(fù)蘇時間可能伴隨細(xì)菌細(xì)胞生長活力的下降，電轉(zhuǎn)化效率并未提高，V8的復(fù)蘇時間維持在4-5 h比較適宜（圖9）。

3 小結(jié)與討論

去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化菌株的方法已在黃單胞菌PX099A上應(yīng)用成功[5]，研究表明V8經(jīng)過去甲基化氮胞苷馴化后，獲得抗100 μmol/L 5-AZA的限制性修飾系統(tǒng)突變菌株，電轉(zhuǎn)化效率最高約為4.5x10²/μ DNA，但5-AZA的濃度不能無限制增加，過高的濃度可能會破壞細(xì)胞的某些組織甚至因細(xì)胞死亡而導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化效率的下降[8]。

SOC作為復(fù)蘇培養(yǎng)基時，電轉(zhuǎn)化效率會相對較高，可達(dá)2.9x10²/μg DNA，可能SOC含的氯化鎂在一定程度上減小了黃單胞菌表面粘多糖的干擾[9]。適宜時間的復(fù)蘇培養(yǎng)能夠使受到電擊穿孔的受損細(xì)胞壁發(fā)生愈合，促使受損的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂，增大電轉(zhuǎn)化效率，但是過長的復(fù)蘇時間反而因?yàn)榧?xì)胞分裂產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)而降低電轉(zhuǎn)化效率[10]，因此V8最佳的復(fù)蘇時間應(yīng)該維持在4.5 h左右。

通過對電轉(zhuǎn)化一系列因素的摸索，得到了V8菌株電轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件，為V8的遺傳操作提供了一種方便、快捷的途徑。前期通過細(xì)菌本身的無細(xì)胞胞體外甲基化待轉(zhuǎn)質(zhì)粒，也成功打破了V8電轉(zhuǎn)化效率為零的限制，在保證V8和重組質(zhì)粒雙重馴化的前提下，進(jìn)行電轉(zhuǎn)操作時得到的最高電轉(zhuǎn)化效率和最優(yōu)電轉(zhuǎn)化因素是否會不同，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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作者簡介：王清（1988-），女，河南項(xiàng)城人，實(shí)習(xí)研究員，碩士，主要從事植物保護(hù)等工作，（電話）15890213237（電子信箱）1173823088@qq.com;

通信作者，劉志堅(jiān)（1966-），男，河南漯河人，研究員，主要從事甘薯品種選育及利用工作，（電話）0395-3781568（電子信箱）liuzj66@126.com。