白樺BpPR1基因生物信息學(xué)分析

安玉婷 李然紅 陳鑫 劉丹

摘要：利用生物信息學(xué)方法，對白樺BpPRI理化性質(zhì)、親水/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及與其他植物PRI蛋白的同源性進(jìn)行了預(yù)測，同時對該基因啟動子的順式作用元件以及基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析。結(jié)果表明，①BpPR1的cDNA全長為816 bp，CDS為53lbp，編碼由176個氨基酸構(gòu)成的穩(wěn)定親水性蛋白，存在跨膜運輸結(jié)構(gòu)，屬于CAP蛋白家族的一員。白樺BpPR1與葡萄、棗親緣關(guān)系較近;②BpPR1基因組結(jié)構(gòu)中含有2個外顯子和3個內(nèi)含子;③BpPR1啟動子含有多個真核生物啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box，還含有與低溫響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、生長素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、細(xì)胞分裂素響應(yīng)相關(guān)的響應(yīng)元件以及MYBHvl結(jié)合位點等，說明該蛋白可能受多種生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控，參與生物與非生物脅迫過程。

關(guān)鍵詞：白樺（Betula platyphylla）;病程相關(guān)蛋白;生物信息學(xué)

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020）12-0171-04

DOI：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.12.038

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

白樺（Betula platyphylla）為樺木科樺木屬落葉木本植物，在亞歐大陸中分布較多。而在中國，其主要分布于東北、華北及西北等地區(qū)[1]。白樺具有適應(yīng)能力強、生長快、材質(zhì)優(yōu)等特點，已成為當(dāng)今社會最有應(yīng)用價值及發(fā)展?jié)摿Φ臉淠痉N類之一，對白樺相關(guān)研究也越來越受到重視[2]。同時，白樺形態(tài)優(yōu)美、表面光潔，常作為城市綠化樹種[3]。白樺皮及白樺汁具有很高的藥用價值，近年來，白樺已被列入重點的科技研究項目之一[4]。植物病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis—related protein，PR）是植物在生物或非生物脅迫下產(chǎn)生的一類抵御不良環(huán)境的蛋白總稱。PR蛋白最早在煙草中被發(fā)現(xiàn)，在病毒侵染植株后產(chǎn)生，并且在侵染及未侵染部位PR基因都有大量表達(dá)[5]。PR廣泛存在于動物、植物中，在單子葉和雙子葉植物中存在更為廣泛，由17個蛋白家族組成，其中，已被發(fā)現(xiàn)功能的有PR2（β一1，3一葡聚糖酶）、PR3（幾丁質(zhì)酶）、PR5（類甜蛋白）、PR6（蛋白酶抑制劑）、PR7（蛋白內(nèi)切酶）、PR9（過氧化物酶）、PRlO（類核糖核酸酶）、PR12（防衛(wèi)素）、PR13（硫素）、PR14（脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白）等。當(dāng)植物受到病原體感染時，PR的表達(dá)量顯著提高[6-8}。PR1作為病程相關(guān)蛋白家族成員之一，現(xiàn)已經(jīng)被證實具有抵抗真菌入侵、限制病毒擴散及抵御逆境脅迫能力等功能。白樺類病斑突變體Imd對半知菌亞門的鏈格孢菌[ Alternaria alternata（ Fr.） Keissler]具有顯著抗性，BpPR1基因表達(dá)量在病原菌入侵時顯著提高。[9]。

本研究參考白樺轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)[10]，獲得白樺BpPR1基因的序列信息，利用生物信息學(xué)方法對其理化性質(zhì)、疏水性/親水性、蛋白結(jié)構(gòu)功能域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)修飾位點及同源性等進(jìn)行了預(yù)測，對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與其他植物PR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其表達(dá)調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

白樺BpPR1基因啟動子和基因序列從CoCe網(wǎng)站獲得（ https：//genomevolution.org/coge/）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、核桃（Juglans regia）和毛果楊（Populus trichocarpa）的基因結(jié)構(gòu)信息從CoGe網(wǎng)站獲得。葡萄、棗（Ziziphusjujuba）、榴蓮（Durio zibethinus）、毛白楊（PoprLILLs to-mentosa）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、耬斗菜（Aquile-gia viridiflora）、豇豆（Vigna unguiculata）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、核桃（Juglans regia）、可可（Theobroma cacao）、鼠尾草（Herrania umbratica）、紅車軸草（Trifolium pratense）、花芽龍眼（Dimocarpus longan）、克萊門柚（Citrus clementina）、毛果楊（Popu-lus trichocarpa），木豆（Cajanus cajan）、栓皮櫟（Quer-cus suber）等植物基因信息在NCBI（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.2 方法

本研究中用到的軟件及網(wǎng)址見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpPR1基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS（http：//gsds. cbi. pku. edu.cn）[11]對BpPR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與擬南芥、葡萄、毛果楊、核桃等植物的PR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果（圖1）表明，BpPR1基因中有3個內(nèi)含子和2個外顯子，CDS為531 bp;毛果楊、擬南芥PR1基因中都含有一個外顯子和兩個內(nèi)含子，CDS長度為485 bp;葡萄PR1基因的CDS也為485 bp，但沒有內(nèi)含子;核桃PR1基因沒有內(nèi)含子，CDS為503 bp;擬南芥、葡萄、毛果楊PR1基因的CDS都是485 bp，其基因結(jié)構(gòu)的差別在于內(nèi)含子不同。

2.2 白樺BpPR1理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam軟件對白樺BpPRI的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，BpPR1基因cDNA全長為816 bp，基因編碼區(qū)（CDS）為cDNA序列中第37至661個堿基，共編碼176個氨基酸，分子質(zhì)量19 265.90D，理論等電點為8.93，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Clu）為10，正電荷殘基總數(shù)（ Arg+Lys）為15，分子式為C842：H1312 N246，O250，S12，總原子數(shù)2 662，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index，Ⅱ）為31.7，脂肪系數(shù)（Aliphatic in-dex）為1.36，平均親水性（GRAVY）水平為-0.178，說明該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白中含量最多的氨基酸為纈氨酸，占1 1.4%，其次為甘氨酸，占9.7%，含量最少的為谷氨酸和苯丙氨酸，分別為1.7%和1.1%。通過ProtScale軟件分析預(yù)測，該蛋白質(zhì)整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.311，在第11個氨基酸處，最小值為-2.656，在第265個氨基酸處，氨基酸的負(fù)值分值大，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水性蛋白（圖2）。

2.3 BpPR1信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過SignaIP-4.1預(yù)測BpPRI信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）表明，原始剪切位點的分值（C值）在第25個氨基酸時有最大值，為0.445，信號肽的分值（S值）在第14氨基酸時有最大值，為0.990，綜合剪切位點的分值（Y值）在第25個氨基酸時有最大值，為0.644，其D-cut off為0.717 06（>0.5），表明BpPRI蛋白含有信號肽，存在跨膜運輸結(jié)構(gòu)。

2.4 BpPR1二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指肽鏈由氫鍵構(gòu)成有規(guī)則的卷曲折疊具有周期性的空間結(jié)構(gòu)，使用SOPMA對白樺BpPRI二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白9.83%可能會形成螺旋（Helix），27.12%可能形成延伸鏈（ Strand），4.14%可能形成轉(zhuǎn)角（Turn），58.64%為無規(guī)卷曲（Random coil），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對BpPR1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測（圖4），不同類型二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊，形成具有空穴的高級結(jié)構(gòu)，可能是某些互作物質(zhì)的結(jié)合位點。

2.5 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別搜索葡萄、棗、榴蓮、毛果楊、榴蓮、橡膠樹、耬斗菜、豇豆、菜豆、核桃、可可、鼠尾草、紅車軸草、花芽龍眼、克萊門柚、毛果楊、木豆、栓皮櫟等17種植物的PRI序列，與白樺BpPRI氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果（圖5）表明，病程相關(guān)蛋白BpPRI與葡萄、棗親緣關(guān)系較近，而與榴蓮、毛白楊等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 白樺BpPR1基因啟動子序列分析

利用PlantCare對白樺BpPR1基因啟動子順式調(diào)控元件進(jìn)行分析。結(jié)果（表2）表明，BpPR1基因含有多個真核生物啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box，含有茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件、光響應(yīng)順式作用元件、低溫響應(yīng)的順式反應(yīng)原件、脫落酸響應(yīng)的順式作用原件、MYBHvl結(jié)合位點、生長素響應(yīng)的順式作用元件、水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、細(xì)胞分裂素的順式作用元件等，說明PR1基因與逆境脅迫密切相關(guān)。乙烯（ET）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病性重要的信號分子，可誘導(dǎo)植物中PRI的表達(dá)[12，13]。白樺BpPR1基因與多種植物生長調(diào)節(jié)劑響應(yīng)有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

病程相關(guān)蛋白是植物中一類重要的蛋白，植物在受到病原體侵染時，水楊酸（ Salicylicacid，SA）、茉莉酸（ Jasmonicacid，JA）、乙烯（Ethylene，ET）等生長調(diào)節(jié)劑含量會隨之改變，同時PR基因會選擇性表達(dá)‘14.15]。PR1作為病程相關(guān)基因重要的一員，對其結(jié)構(gòu)功能的研究也在逐步進(jìn)行。侯麗霞等[16]研究表明葡萄PRI可對多種脅迫產(chǎn)生響應(yīng)應(yīng)答，霜霉病菌、低溫、鹽、干旱、水楊酸、脫落酸、茉莉酸、一氧化氮、過氧化氫和硫化氫等可誘導(dǎo)其大量表達(dá)。馬立功等[17]對向日葵的研究發(fā)現(xiàn)PR1在鹽脅迫、干旱脅迫、核盤菌及其代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)下可上調(diào)表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn)接到煙草中，獲得轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因植株也提高了對核盤菌的抗性。PR1基因的表達(dá)受多種基因調(diào)控，PR1基因是否具有抗病性與其基因結(jié)構(gòu)有關(guān)。張凱敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳的TbPR1基因的編碼區(qū)長為537 bp，共編碼178個氨基酸，與白樺BpPR1較為接近。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)葡萄中煙草野火病菌只有在堿性PRI存在的情況下才不表達(dá);Bonasera等[20]將PR1基因轉(zhuǎn)入到蘋果中，發(fā)現(xiàn)蘋果植株并沒有表現(xiàn)出對相應(yīng)病菌的抗性。PR蛋白基因不僅具有一定的抗病功能，同時對植物生長、抵抗逆境脅迫、抗植株衰老及生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)等方面同樣發(fā)揮著至關(guān)重要作用。

本試驗利用生物信息學(xué)方法對BpPR1的基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件、理化性質(zhì)及同源性等進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，BpPR1的cDNA全長為816 bp，CDS為531 bp，編碼176個氨基酸，理論等電點為8.93，為堿性蛋白質(zhì)，理論上具有較高的抗菌性。對其同源性進(jìn)行比對，BpPRI與葡萄、棗親緣關(guān)系較近。BpPR1基因結(jié)構(gòu)中含有3個內(nèi)含子和2個外顯子，與擬南芥、毛果楊等PR1基因結(jié)構(gòu)有所不同，但其編碼區(qū)大小差別不大。PR蛋白是受多基因調(diào)控的蛋白質(zhì)，不同植物的表達(dá)量存在相對差異。對啟動子順式反應(yīng)原件進(jìn)行分析得到，BpPRI中含有茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件、光響應(yīng)順式作用元件、低溫響應(yīng)的順式反應(yīng)原件、脫落酸響應(yīng)的順式作用原件、MYBHvl結(jié)合位點、生長素響應(yīng)的順式作用元件、水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、細(xì)胞分裂素的順式作用元件等，說明BpPRI參與多種植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答，該蛋白如何通過生長調(diào)節(jié)劑響應(yīng)調(diào)控白樺抗病性還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]李萌，哈努拉·塔斯肯，陳卓，等白樺4CL基因啟動子克隆及表達(dá)分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2017，33（5）：29-34

[2]王家啟，張曦，李莉，白樺HD-Zip基因家族生物信息學(xué)及應(yīng)答鹽脅迫分析[J].植物研究，2018，38（6）：931- 938.

[3]申婷婷，姜靜，劉桂豐，等白樺BpCesA基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析[J].植物研究，2016，36（6）：909-916.

[4] YANG C P Research progress on genetic improvement of Betulaplatyphylla SukEJ] Front Agr Sci Eng， 2017 .4（4）： 391-401.

[5]佟志鵬，安夢楠，丁鋮松，等.植物病程相關(guān)蛋白PR-NP24研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2019（ 11）：3542-3548.

[6] FARRAKH S .WANG M N . CHEN X M. PaLhogenesis-related pro-tein genes involved in race-specific all-stage resistance and non-race specific high-temperature adult-plant resistance to Pu.cciniastriiformis f.sp.tritici in wh e at[ J ] . Journal of integrativ e agriculture ，2018.17（11） ： 2478-2491.

[7] ZHANC G. LI Y M， ZHANC Y. et al. Cloning and characterizationof a pathogenesis-related protein gene TaPRIO from wheat inducedby stripe rust pathogen [Jl. Agricuhural sciences in China. 2010.9（ 4） ： 549-556.

[8]張玉，楊愛國，馮全福，等，植物病程相關(guān)蛋白及其在煙草中的研究進(jìn)展 [J].生物技術(shù)通報 ， 2012（ 5 ） ： 21-23.

[9] L1 R H . CHEN S. LIU G F. eL al. Characterization and idenLifcationof a woody lesion mimic mutant Imd ， showing defence response andresistance to Alternaria alcernate in birch [Jl. Science citation in-dex.2017.9： 1-12.

[10] SALOJARVI J. SMOLANDER O P. NIEMINEN K. el al. Cenomesequencing and population genomic analyses provide insights inLo the adaptive landscape of silver birch [J] . Nature genetics. 2017 ，49（6） ：904-912.

[11] HU B. JIN J. GUO A Y. GSDS 2.0 ： An upgraded gene ieature vi-sualizaLion serverLJl . Bioinformattics.2015 .31 （ 8） ： 1296-1297.

[12] LE H G. HEITZ T. MESTRE P. et al. Characterization of Vitis vi-nifera NPRI homologs involved in che regulation of pathogenesis-related gene expression[J].BMC plant biology， 2009，9：54-64.

[13] SABATER J A B，ALMACRO L，BELCHI N S，et al Induction ofsesquiterpenes， phytoesterols and extracellular pathogenesis-relat-ed proteins in elicited cell cultures of Capsicum annuum[Jl. PlantPhysiol. 2010. 167 （15）： 1273-1281.

[14]楊瑞瑞，易小婭，曾幼玲.PRlO的結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及功能的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014.30（4）：251-258.

[15]王勇剛，曾富華，吳志華，等，植物誘導(dǎo)抗病與病程相關(guān)蛋白[J]湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002.28（2）：177-182.

[16]侯麗霞，高超，車永梅，等葡萄病程相關(guān)蛋白l基因的克隆和表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報，2012. 48（1）：57-62.

[17]馬立功，張勻華，孟慶林，等.向日葵病程相關(guān)蛋白HaPRl基因的克隆與功能[J].作物學(xué)報，2015 .41（12）：1819-1827.

[18]張凱敏，王玉成，楊桂燕，等，檉柳TpPRI基因的克隆與表達(dá)分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013. 37（2）：45-49

[19] 11 Z T，DHEKNEY S A. CRAY D J PR-I gene family of grape-vine： Auniquely duplicated PR-I gene from a Vitis interspecifichybrid confers high level resistance to bacterial disease in trans-genic LobaccoLJl. Plam Cell Rep. 2011， 30： l-ll.

[20] BONASERA J M， KIM J F，BEER S V.PR genes of apple： Identi-fication and expression in response to elicitors and inoculation with Erwinia amvlovora[J]. BMC Plant Biol， 2006，6：23-34.

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31800558）

作者簡介：安玉婷（1991-），女，黑龍江安達(dá)人，在讀碩士研究生，研究方向為植物學(xué)，（電話）18904534279（電子信箱）swxanyuting@126.com;通信作者，李然紅，（電話）18504539007（電子信箱）swxlrh@126.com。