布比卡因通過調(diào)節(jié)AMPK對人膀胱癌T24細胞惡性增殖、氧化應激及凋亡的影響

陳明明，司馬靚杰，劉巍巍，張宜林

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471003)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在男性的惡性腫瘤中排名第6[1-3]。我國膀胱癌的發(fā)病率和死亡率逐年快速上升[4-5]。盡管在過去的10年中，癌癥的治療方式(包括手術、放射療法和化學療法)得到了明顯改善，但膀胱癌患者的預后并未得到顯著提高[6-9]。 因此，迫切需要尋找新的治療藥物和治療靶標以改善該疾病患者的預后。最近的研究表明，局部麻醉藥可能在癌癥治療中發(fā)揮有益作用，能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[10]。布比卡因是廣泛用于長期、局部和區(qū)域麻醉的麻醉藥[11]。研究已證實布比卡因可誘導前列腺癌細胞的凋亡和抑制胃癌的發(fā)生[12-13]。但探討局部麻醉劑對軟骨形成腫瘤影響的研究較少。本研究探討布比卡因?qū)θ税螂装㏕24細胞增殖、氧化應激和凋亡的影響及其機制，以期為布比卡因應用于治療膀胱癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

布比卡因(百奧萊博科技有限公司，中國)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(Invitrogen公司，美國)；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒 (PIERCE公司，美國) ；MatrigelTM底膜基質(zhì) (BD公司 ，美國) ；Caspase-3、Bax、Bcl-2、 Ki67、AMPKα1抗體 (Sigma公司，美國)；HRP標記的山羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司，美國)；細胞凋亡檢測試劑盒 (Annexin PE/7-AAD，南京凱基生物有限公司,中國) ；Transwell小室及人工基底膜 (BD公司 ,美國) ；高速低溫離心機(Beckman公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、Powerpac電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國)；FACS Vantage SE 流式細胞儀(BD公司，美國)；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP (UVP公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

T24細胞在含有10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長，置于5%(φ)CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。細胞匯合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.3 CCK8檢測細胞存活率

選擇不同劑量(0、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、25、50、100 mmol/L)的布比卡因處理膠質(zhì)瘤T24細胞，將處理后的U-87細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h后對細胞進行相應轉(zhuǎn)染后，根據(jù)試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK8試劑并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測各組吸光度(A)，繪制折線圖并計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖

將T24細胞隨機分為4組，分別用0、1.25、2.5、5 mmol/L的布比卡因處理T24細胞。48 h后，細胞移入6孔板，每孔1 000個細胞，孵育10 d。在培養(yǎng)過程中每3天更換1次新鮮的完整培養(yǎng)基。然后將細胞菌落用4%(φ)多聚甲醛固定15 min，吸取多聚甲醛棄掉，加入1 mL/孔0.1%結(jié)晶紫孵育15 min,PBS洗滌3次。記錄細胞克隆數(shù)，并在顯微鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測增殖標記物的表達

使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過超微紫外光分光光度計在260和280 nm處測定吸光度。 按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit進行PCR，分別在95 ℃ 15 s 和60 ℃ 60 s條件下使用ABI 7500將反應激活。用于該反應的Ki67、Survivin和GAPDH的引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取處理過的T24細胞，以1×106個/孔的細胞量接種至6孔板中，置37 ℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。分別收集每個孔內(nèi)的細胞。按凋亡檢測試劑盒說明書操作，用Annexin V-FITC和pro-pidium iodide (PI) 雙染法在流式細胞儀上進行細胞凋亡檢測，使用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 試劑盒檢測SOD的活性和MDA、GSH的水平

取處理過的T24細胞，分別采用SOD、MDA、GSH試劑盒測定SOD、GSH活性及MDA的含量。操作步驟嚴格按照大鼠SOD、MDA、GSH試劑盒說明書進行。另外，為驗證布比卡因是否通過AMPK來影響細胞增殖、氧化應激及凋亡，本研究引入AMPK抑制劑Compound C(CC)，將T24細胞分為4組：0 mmol/L組、5 mmol/L組布比卡因、CC組和5 mmol/L布比卡因組+CC組，檢測SOD活性。

1.8 免疫印跡法

取處理過的T24細胞，使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗 (Caspase-3,1∶1 000; Bax,1∶1 000; Bcl-2,1∶1 000; Ki67,1∶1 000; AMPKα1,1∶1 000)于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設置曝光參數(shù)，檢測目的條帶對應化學發(fā)光強弱。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的布比卡因?qū)24細胞活力的影響

如圖1所示，不同劑量布比卡因處理人膀胱癌T24細胞24 h后，與0 mmol/L組比較， 0.313、0.625、1.25、2.5、5 mmol/L組的T24細胞存活率無顯著變化(P>0.05)；10、25、50、100 mmol/L組的T24細胞存活率以布比卡因濃度依賴的方式顯著降低(P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。

與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.2 布比卡因?qū)24細胞增殖的影響

如圖2所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L布比卡因組的細胞克隆形成率無顯著變化(P>0.05)，而 2.5 mmol/L和5 mmol/L組的克隆形成率呈劑量依賴性顯著減少(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. 克隆形成實驗(200×)；B. 克隆形成實驗的直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.3 布比卡因?qū)24細胞Ki67和 Survivin的mRNA水平的影響

如圖3所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的Ki67和Survivin的mRNA水平無顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的Ki67 mRNA和Survivin mRNA水平呈劑量依賴性顯著降低(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.4 布比卡因?qū)24細胞凋亡的影響

如圖4所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的細胞凋亡率呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

A.細胞凋亡分布圖； B.細胞凋亡情況直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.5 布比卡因?qū)Φ蛲鱿嚓P蛋白表達的影響

如圖5所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達比例無顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達比例呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A.蛋白印跡實驗； B.蛋白印跡實驗的直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.6 布比卡因?qū)OD活性、GSH和MDA含量的影響

如圖6所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的SOD和GSH含量無顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L組的SOD和GSH含量呈劑量依賴性顯著降低(P<0.05)；而1.25 mmol/L組的MDA含量無顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mol/L組的MDA含量呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. SOD活性； B. MDA含量； C. GSH含量。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.7 布比卡因?qū)MPK水平、T24細胞增殖、氧化應激以及凋亡的影響

如圖7(A)所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L布比卡因組的AMPK蛋白水平無顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L組的AMPK蛋白水平呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)，表明布比卡因可促進AMPK的表達。如圖7(B)所示，與0 mmol/L組比較，5 mmol/L組SOD活性顯著降低(P<0.05)，CC組SOD活性顯著升高(P<0.05)；而與CC組比較，5 mmol/L布比卡因組+CC組SOD活性顯著降低(P<0.05)。如圖7(C)(D)所示，與0 mmol/L組比較，5 mmol/L組AMPKα1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例顯著升高(P<0.05)；CC組AMPKα1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例降低(P<0.05)。與CC組比較，5 mmol/L組+CC組AMPKα1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因; 5. 抑制劑Compound C; 6. 抑制劑Compound C+5 mmol/L布比卡因。A. AMPKα1的蛋白表達； B. SOD活性； C.引入抑制劑后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表達； D.引入抑制劑后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表達直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05；與CC組比較：#P<0.05。

3 討論

局部麻醉藥的作用范圍很廣，越來越多的證據(jù)表明，局部麻醉劑對各種不同類型的細胞都是有毒的[14-15]。布比卡因是使用最廣泛的局部麻醉藥之一，據(jù)報道布比卡因?qū)Χ喾N軟骨瘤細胞均有毒性，布比卡因?qū)е录毎盍Τ蕜┝亢蜁r間依賴性顯著降低[16]。本研究通過不同劑量布比卡因處理人膀胱癌T24細胞24 h后，T24細胞的存活率以布比卡因濃度依賴的方式降低。因此，本研究選擇無顯著毒性的布比卡因劑量 (0、1.25、2.5、5 mmol/L) 進行后續(xù)實驗。

癌細胞無限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。有報道稱，在一定濃度范圍內(nèi)布比卡因可誘導卵巢癌和前列腺癌細胞死亡，并抑制結(jié)腸癌和胰腺癌細胞的增殖[12,17]。研究發(fā)現(xiàn)布比卡因可顯著減少呈Ki67陽性核染色的Caco-2細胞數(shù)量，抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[17]。同樣，Xuan等[12]證實布比卡因治療能使SKOV-3和PC-3細胞中Ki-67陽性細胞減少，抑制卵巢癌和前列腺癌細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理后膀胱癌T24細胞克隆形成率降低，Ki67 mRNA和Survivin mRNA的表達降低，提示布比卡因能夠抑制膀胱癌T24細胞惡性增殖。

誘導細胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要手段之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)隨著布比卡因濃度的增加和暴露時間的延長，所有腫瘤組的凋亡細胞數(shù)量均有所增加[16]。Chang等[19]在體外研究中發(fā)現(xiàn)布比卡因能有效誘導人乳腺腫瘤細胞凋亡。同樣地，用布比卡因治療人甲狀腺癌細胞會導致細胞活力下降和菌落形成。這種治療通過線粒體損傷和絲裂原活化蛋白激酶的激活誘導細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理膀胱癌T24細胞后，Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達比值和細胞凋亡率均升高，提示布比卡因可誘導膀胱癌T24細胞凋亡。

GSH和SOD是細胞內(nèi)抗氧化劑，MDA是脂質(zhì)過氧化的指標，均在細胞氧化應激中起重要作用[21-22]。由于清除活性氧的損害，GSH的消耗導致氧化損傷[23]。SOD可以中和自由基，保護細胞免受活性氧損傷[24]。研究發(fā)現(xiàn)布比卡因通過降低SOD活性和GSH含量，增加MDA含量，誘導SH-SY5Y細胞的氧化損傷[25]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理膀胱癌T24細胞后SOD活性和GSH含量降低，MDA含量升高，結(jié)果提示布比卡因可誘導膀胱癌T24細胞氧化應激。

AMPK被認為是細胞能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，通過它感知細胞內(nèi)的代謝狀態(tài)，特別是在ATP缺乏的情況下，并且與細胞應激的調(diào)節(jié)有關[26]。最近研究表明AMPK可能參與了布比卡因誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的細胞毒性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)布比卡因通過上調(diào)AMPKα1蛋白表達水平，降低Ki67蛋白表達水平和SOD活性，上調(diào)Cleaved Caspase-3/Caspase-3的蛋白表達比值，提示布比卡因可通過上調(diào)AMPK水平抑制人膀胱癌T24細胞惡性增殖并誘導細胞氧化應激和凋亡。

綜上所述，布比卡因可通過上調(diào)AMPK水平抑制人膀胱癌T24細胞惡性增殖并誘導細胞氧化應激和凋亡，為布比卡因應用于臨床治療膀胱癌提供了實驗依據(jù)。