川芎嗪對(duì)尿酸鈉關(guān)節(jié)炎大鼠的影響及機(jī)制探討

顧翀浩，于 瀟，蔣 濤*

（1.常州市中醫(yī)院骨傷科，江蘇 常州 213000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 221000）

隨著生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，因嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄減少所引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率正逐步升高，且大部分患者經(jīng)急性發(fā)作階段后會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展為慢性病[1]。研究[2]顯示，引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要病理基礎(chǔ)為尿酸鈉結(jié)晶沉積于滑膜組織，另外炎性細(xì)胞因子的大量釋放也參與了疾病的發(fā)病過(guò)程。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究[3-4]顯示，川芎嗪對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎、膝骨性關(guān)節(jié)炎等多種關(guān)節(jié)疾病模型動(dòng)物均發(fā)揮較好的治療作用。本研究通過(guò)構(gòu)建尿酸鈉關(guān)節(jié)炎大鼠模型，旨在觀察川芎嗪對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠，6～8月齡，體質(zhì)量（255.0±15.0）g，購(gòu)于上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0012。磷酸川芎嗪片（麗珠集團(tuán)利民制藥廠，規(guī)格：每片50 mg，生產(chǎn)批號(hào)：170814，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H44024348）；秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：每片0.5 mg，生產(chǎn)批號(hào)：20180313，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H53021369）。尿酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司）；白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-33（IL-6、IL-12、IL-33）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65（NF-κB P65）抗體（英國(guó)Abcam公司）等。JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DM LB2型雙目顯微鏡（德國(guó)LECIA公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模 參照Coderre等[5]方法構(gòu)建痛風(fēng)大鼠模型，大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后適當(dāng)彎曲膝關(guān)節(jié)，于后右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)處用6號(hào)注射針45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)注入尿酸鈉溶液200 μL，選取10只大鼠為正常組僅注射200 μL 0.9% NaCl溶液。

1.2.2 分組及藥物干預(yù) 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組灌胃川芎嗪50 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃秋水仙堿100 μg/kg，模型組和正常組灌胃等量0.9% NaCl溶液。每日1次，連續(xù)干預(yù)5 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 1）踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)變化。于藥物干預(yù)后1、2、5 d對(duì)各組大鼠受試踝關(guān)節(jié)相同部位采用無(wú)彈性軟尺測(cè)量周長(zhǎng)。2）細(xì)胞因子檢測(cè)。藥物干預(yù)結(jié)束后，采集大鼠頸動(dòng)脈血液標(biāo)本后，斷頭處死各組大鼠，并取踝關(guān)節(jié)滑膜組織。血液標(biāo)本經(jīng)5 000 r/min離心15 min，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清中IL-6、IL-12、IL-33、TNF-α 質(zhì)量濃度。3）大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)。將大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，并制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟，蘇木精-伊紅染色（HE）后，以中性樹膠封片后鏡檢，采用改良Mankin’s法評(píng)價(jià)大鼠軟骨退變程度，評(píng)分越高說(shuō)明退變?cè)絿?yán)重。4）大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中p-Akt、NFκB p65蛋白表達(dá)。提取各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織總蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg進(jìn)行蛋白免疫印跡（WB）檢測(cè)，以GADPH為參照，分析各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中p-Akt、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)變化 見表1。

2.2 細(xì)胞因子水平 見表2。

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)變化（） cm

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)變化（） cm

注：與正常組比較，# P ＜0.05，與模型組比較，△P ＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P ＜0.05

表2 各組大鼠細(xì)胞因子水平變化（） ng/mL

表2 各組大鼠細(xì)胞因子水平變化（） ng/mL

注：與正常組比較，# P ＜0.05，與模型組比較，△P ＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P ＜0.05

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)變化 正常組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、排列整齊、無(wú)炎性滲出物，軟骨細(xì)胞基本正常；模型組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔狹窄、滑膜組織增生、軟骨表面粗糙，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，踝關(guān)節(jié)軟骨破壞緩解，軟骨表面色澤明亮，滑膜組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠Mankin’s評(píng)分均高于正常組，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組評(píng)分低于模型組，且實(shí)驗(yàn)組低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組大鼠軟骨組織病理學(xué)形態(tài)（×200）

表3各組大鼠Mankin’s評(píng)分及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，與模型組比較，△P ＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P ＜0.05

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織p-Akt、NF-κB p65蛋白表達(dá)量均升高，且實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組低于模型組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬于代謝障礙性關(guān)節(jié)炎癥，是多種因素相互影響的結(jié)果，中醫(yī)將痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎歸屬于“歷節(jié)”“白虎病”“痹證”范疇，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，患者多陽(yáng)氣不足、素體虧虛、營(yíng)衛(wèi)失和，風(fēng)濕熱邪內(nèi)侵以痹阻骨節(jié)、筋脈及肌肉，或因膏粱厚味食用過(guò)多及情志因素致使津液輸布失常，聚濕成痰濁，蘊(yùn)于關(guān)節(jié)之處，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)閉阻、不通，并出現(xiàn)腫脹、麻木、活動(dòng)受限等癥狀?！端貑?wèn)·痹論》有云“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為病”，素體內(nèi)有蓄熱，外感受風(fēng)寒而成風(fēng)濕熱痹，外邪痹阻經(jīng)脈，氣血津液運(yùn)行不暢，痰瘀內(nèi)積而引發(fā)病變[6-7]。

川芎歸肝、膽、心經(jīng)，具有活血化瘀行氣，祛風(fēng)止痛功效。《本草綱目》云：“川芎，血中氣藥也……辛以散之，故氣郁者宜之”。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者由于尿酸鈉結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)周圍組織，并與滑膜液中的免疫球蛋白結(jié)合，炎癥細(xì)胞聚集后釋放出花生四烯酸引起的急性炎癥反應(yīng)；花生四烯酸通過(guò)脂氧化酶和環(huán)氧化酶途徑生成炎性介質(zhì)前列腺素和白三烯，進(jìn)而促使單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6等多種炎性因子。因此阻斷或抑制關(guān)節(jié)局部炎癥可達(dá)到緩解病情的目的[8-10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)川芎嗪干預(yù)后5 d實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IL-6、IL-12、IL-33、TNF-α 水平低于模型組及陽(yáng)性對(duì)照組，提示川芎嗪能夠有效降低尿酸鈉造成的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)體炎癥反應(yīng)。近年來(lái)研究[11-12]顯示，川芎嗪能夠降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中前列腺素E2及一氧化氮水平，減輕膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)；可減輕關(guān)節(jié)軟骨退變，促進(jìn)軟骨的自身修復(fù)；通過(guò)抑制基質(zhì)降解，抑制關(guān)節(jié)細(xì)胞凋亡；還可降低骨內(nèi)壓，保護(hù)和修復(fù)早期膝骨性關(guān)節(jié)軟骨損傷。

NF-κB信號(hào)通路在炎性反應(yīng)過(guò)程中扮演了重要的角色，可調(diào)控多種炎性因子的分泌，通常NF-κB以p50/p65的二聚體形式與抑制性蛋白IκB相結(jié)合，細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，可通過(guò)Toll-like receptor-4受體激活PI3K-Akt等信號(hào)通路，IκB能夠被磷酸化，進(jìn)而泛素化被降解；而NF-κB釋放后，由于核轉(zhuǎn)位的發(fā)生進(jìn)而與靶基因的順式作用元件相結(jié)合，誘導(dǎo)各種致炎因子表達(dá)[13-14]。研究[15-16]表明，NF-κB參與肺部炎性反應(yīng)過(guò)程中炎性細(xì)胞的激活，對(duì)炎性因子，如IL-6、IL-8、TNF-α 等起調(diào)控作用。研究[17-18]顯示，川芎嗪可抑制NF-κB p65核移位抑制脂多糖所致的心肌損傷；抑制NF-κB P65磷酸化減輕脂多糖誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組踝關(guān)節(jié)滑膜組織p-Akt、NF-κB p65蛋白表達(dá)量低于模型組，提示川芎嗪對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療，可能是通過(guò)降低NF-κB通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低血清炎性因子表達(dá)發(fā)揮作用。