青棗果酒釀造工藝優(yōu)化及其香氣成分分析

原潞，李桂峰，燕妮，吳建虎，杜俊杰

（山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004）

棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科植物棗樹的果實，在我國已有四千年的歷史，其種植面積廣泛，具有藥食同源的功效[1]。棗果富含碳水化合物、酚類化合物、皂苷類、生物堿類、三萜酸[2-5]等，具有增加免疫力，防治心血管疾病，預(yù)防癌癥，抗氧化[6-8]等功效。山西是中國棗果重點產(chǎn)區(qū)之一，棗的種植面積逐年增加，年產(chǎn)量逐年提高，但由于其產(chǎn)業(yè)化程度低，缺乏市場競爭力，已經(jīng)不能滿足市場的需要，造成大量棗滯銷，棗業(yè)面臨嚴(yán)峻困局[9]。因此，采用新思路和開發(fā)新產(chǎn)品改變棗業(yè)低迷不振的現(xiàn)狀迫在眉睫。

目前，有關(guān)棗產(chǎn)品的研究主要集中在紅棗酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及紅棗汁與飲料加工工藝等方面，如彭方杰等采用Box-Behnken試驗設(shè)計大棗果酒發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化[10]。Jingjing Guo等對經(jīng)酶解和未經(jīng)酶解處理的紅棗酒精飲料的化學(xué)成分和揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究[8]。研究發(fā)現(xiàn)，青綠色棗果總酚、總黃酮、維生素含量以及抗氧化能力均明顯高于成熟的紅棗，因此開發(fā)青棗產(chǎn)品更加符合人們對高營養(yǎng)的產(chǎn)品的消費需求。果酒是以水果為原料經(jīng)發(fā)酵釀造而成的低度飲料酒，其營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特[11]。但以青棗為原料釀造果酒的相關(guān)研究未見報道。

本研究以青棗作為原料釀造果酒，酒精度和感官評分為綜合評價指標(biāo)，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對青棗果酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對青棗果酒的香氣成分進(jìn)行測定和分析，釀造的果酒，不僅其營養(yǎng)成分含量高、抗氧化能力強(qiáng)和香氣飽滿，還解決了傳統(tǒng)紅棗酒易渾濁、略帶苦味等的問題，為開發(fā)棗產(chǎn)品提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青棗：山西木棗，采于山西省呂梁市臨縣三交鎮(zhèn)；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（食品級，酶活力30 000 U/g）：河北格貝達(dá)生物科技有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）：煙臺帝伯仕有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；DPX-90520B-2型恒溫培養(yǎng)箱：上海華光儀器儀表廠；75 μm CAR/PDMS型SPME萃取頭：美國Supelco公司；6890N-5973氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 青棗果酒釀造工藝流程及操作要點

青棗→挑選、清洗→軟化→果膠酶處理→調(diào)糖→SO2護(hù)色→酵母活化→接種發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清過濾→灌裝→檢驗→成品

挑選無腐爛、無霉變的青棗，清洗，去核；青棗和水比例為 1 ∶2（g/mL），90 ℃ 的水浴軟化 8 min ～10 min；進(jìn)行酶解，果膠酶用量0.3%，在40℃酶解3 h；榨汁，濾去棗皮等物質(zhì)，得到青棗汁；添加白砂糖調(diào)整果汁的初始糖度，接種一定量酵母，于23℃～25℃恒溫箱發(fā)酵，一定時間內(nèi)完成主發(fā)酵。濾去酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生的代謝物殘渣，進(jìn)行后發(fā)酵，時間為1個月。采用巴氏滅菌的方法，對青棗果酒進(jìn)行滅菌處理，即得成品。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 初始糖度對青棗果酒的影響

固定酵母添加量0.3%，發(fā)酵時間7 d，SO2添加量80mg/L，初始糖度分別為18%、20%、22%、24%、26%，以酒精度和感官評分為評價指標(biāo)，對青棗果酒進(jìn)行品質(zhì)評價。

1.3.2.2 酵母添加量對青棗果酒的影響

固定初始糖度22%，發(fā)酵時間7 d，SO2添加量80 mg/L，酵母添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以酒精度和感官評分為評價指標(biāo)，對青棗果酒進(jìn)行品質(zhì)評價。

1.3.2.3 發(fā)酵時間對青棗果酒的影響

固定初始糖度22%，酵母添加量0.3%，SO2添加量 80 mg/L，發(fā)酵時間分別為 3、5、7、9、11 d，以酒精度和感官評分為評價指標(biāo)，對青棗果酒進(jìn)行品質(zhì)評價。

1.3.2.4 SO2添加量對青棗果酒的影響

固定初始糖度22%，酵母添加量0.3%，發(fā)酵時間7 d，SO2添加量分別為 0、40、80、120、160 mg/L，以酒精度和感官評分為評價指標(biāo)，對青棗果酒進(jìn)行品質(zhì)評價。

1.3.3 青棗果酒發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，作四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以酒精體積分?jǐn)?shù)（Y1）和感官評分（Y2）為雙響應(yīng)值，對青棗果酒主發(fā)酵工藝條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平編碼表Table 1 Coding of factors and levels of response surfaces

1.3.4 指標(biāo)測定

酒精度的測定：參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中酒精計法[12]。

感官評分：參照文獻(xiàn)[12-13]方法。選7名食品專業(yè)人員分別從產(chǎn)品的外觀、香氣、滋味、典型性4個方面進(jìn)行感官評分，采用百分制。具體感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官試驗評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Grade standard of sensory experiment

1.3.5 青棗果酒香氣成分分析

樣品處理：取10 mL裝入頂空瓶，密封，以頂空方式萃取青棗果酒中的揮發(fā)性成分。條件為：恒溫水浴鍋60℃，萃取30 min。色譜條件分析：HP-5MS（30 m×0.25μm×0.25mm）色譜柱；載氣為氦氣，流速為1mL/min；進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫條件：初始柱溫40℃保持2 min，再以6℃/min升溫至300℃，保持5 min，溶劑延遲：3.5 min。質(zhì)譜條件分析：電離子源（electron ionization，EI），離子源溫度230℃；電子能量70eV；四級桿溫度為150℃，倍增管電壓1.2kV，掃描質(zhì)量范圍m/z35～550。定性和定量分析：使用NIST Library數(shù)據(jù)庫進(jìn)行譜圖分析，對檢測出的香氣物質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)定性分析，通過峰面積歸一化法計算各物質(zhì)的相對含量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 青棗果酒單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 初始糖度對青棗果酒發(fā)酵的影響

初始糖度對青棗果酒發(fā)酵的影響如圖1所示。果酒酵母菌通過發(fā)酵葡萄糖等有機(jī)物進(jìn)行酒精發(fā)酵，因此，需要添加一定量的糖。

圖1 初始糖度對果酒發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of the initial sugar on fermentation of fruit wine

由圖1可知，隨著發(fā)酵液初始糖濃度的增加，酒精度逐漸增高，感官評分先上升后下降。在初始糖濃度過低時，酒度和感官評分值均較低，說明明顯影響了酵母的發(fā)酵過程[15]，酒精度含量低，風(fēng)味不足。而糖度過高時，酵母自身繁殖利用增多，導(dǎo)致酒度低且成本投入大。綜合考慮，選取20%、22%、24%作為青棗果酒發(fā)酵響應(yīng)面對應(yīng)因素水平，以確定最佳發(fā)酵條件。

2.1.2 酵母添加量對青棗果酒發(fā)酵的影響

酵母添加量對青棗果酒發(fā)酵的影響如圖2所示。

圖2 酵母添加量對果酒發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of yeast addition on fermentation of fruit wine

由圖2可知，隨著酵母添加量的增多，發(fā)酵液的酒精度呈快速增長的趨勢，當(dāng)酵母添加量為0.3%時，酒精度達(dá)到最大值為13.23%vol；感官評分也達(dá)到最高值85.43分。酵母添加量大于0.3%時，酒精度和感官評分開始下降，這可能是因為隨著酵母接種量的增大，發(fā)酵太快，導(dǎo)致發(fā)酵液中的糖更多的消耗于酵母本身生長，酒度不高，酒體寡淡[16-17]。綜合考慮，選取0.2%、0.3%、0.4%作為青棗果酒發(fā)酵響應(yīng)面對應(yīng)因素水平，以確定最佳發(fā)酵條件。

2.1.3 發(fā)酵時間對青棗果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間對果酒的酒精含量和風(fēng)味品質(zhì)影響較大。發(fā)酵時間對青棗果酒發(fā)酵的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵時間對果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of fermentation time on fermentation of fruit wine

由圖3可知，青棗果酒在發(fā)酵前7 d時，酒精度增長較快，之后增長速度趨于緩慢，可能是由于發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化較完全，發(fā)酵基本接近終點；此時酒體濃郁，口感適宜，果酒品質(zhì)優(yōu)良。為了保持果酒口感，選擇發(fā)酵時間為7、9、11 d作為響應(yīng)面對應(yīng)因素水平，以確定最佳條件。

2.1.4 SO2添加量對青棗果酒發(fā)酵的影響

SO2添加量對青棗果酒發(fā)酵的影響如圖4所示。

圖4 SO2添加量對果酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of SO2on fermentation of fruit wine

由圖4可知，隨著SO2添加量的增多，酒精度逐漸降低，可能是因為剛加入的SO2會抑制酵母菌的活性，影響發(fā)酵的結(jié)果。感官評分呈現(xiàn)先下降后上升再緩慢下降；當(dāng)SO2添加量為80 mg/L時，達(dá)到最大值79.57分。綜合上述各因素考慮，選取40、80、120mg/L作為青棗果酒發(fā)酵響應(yīng)面對應(yīng)因素水平，以確定最佳發(fā)酵條件。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化青棗果酒釀造工藝

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

以果酒酒精度（Y1）和感官評分（Y2）作為雙響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 3 Design program and results of response surfaces

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

續(xù)表4 回歸模型方差分析Continue table 4 Variance analysis of the regression model

應(yīng)用對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，分別得到酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的二次回歸模型分別為：

由表 4 可知，酒精度（Y1）和感官評分（Y2）模型的P值均＜0.000 1，可知回歸模型方差極顯著，擬合度較好；失擬項P值分別為0.050 2和0.575 5，均大于0.05，不顯著，表明通過試驗得到的二次回歸方程能較好地預(yù)測結(jié)果[18-19]。以酒精度為響應(yīng)值時，一次項A、B、C交互項 AC、AD、BC、BD 以及二次項 B2、C2、D2均表現(xiàn)為顯著；在模型交互項中，AB、CD交互項的顯著性較差，說明發(fā)酵是多因素相互作用的結(jié)果。通過主因子效應(yīng)分析可以得出[20-21]，試驗因素對酒精度影響的強(qiáng)弱順序為：初始糖度＞發(fā)酵時間＞酵母添加量＞SO2添加量。以感官評分為響應(yīng)值時，一次項A、C、D和交互項AB、AD、BC、CD ，二次項 B2、C2、D2均為顯著，同樣，試驗因素對感官評分影響的強(qiáng)弱順序為：初始糖度＞發(fā)酵時間＞SO2添加量＞酵母添加量。

二次多項式模型酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的決定系數(shù)分別為0.972 9和0.979 5，這表明所建立的模型能夠較好地擬合因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)值相互結(jié)合的響應(yīng)面和等高線分析

圖5 各因素交互作用對果酒酒精度和感官評分影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of the effects of the interaction of various factors on wine alcohol and sensory score

各因素交互作用對果酒酒精度和感官評分影響的響應(yīng)面見圖5。由圖5可知，在所選范圍內(nèi)是存在極點的，兩者相互之間影響的三維響應(yīng)面和等高線均呈現(xiàn)橢圓形，存在極值，且坡度較陡，表明三者之間的交互作用顯著；隨著初始糖度和酵母添加量、發(fā)酵時間、SO2添加量之間變化時，酒精度和感官評分均呈現(xiàn)出先升高后緩慢下降趨勢，因為前者坡度較陡交互作用顯著，而后者之間交互作用的坡度較平緩交互作用不顯著[21-22]。

2.2.3 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和驗證

通過Design expert軟件分析得到青棗果酒釀造的最優(yōu)工藝條件為：初始糖度24%，酵母添加量0.32%，發(fā)酵時間8.92 d，SO2添加量 92.08 mg/L，此時，所釀得的青棗果酒酒精度和感官評分的預(yù)測值分別為：15.2%vol、88.96分?？紤]到實際操作的可行性，修正工藝條件為：初始糖度24%，酵母添加量0.3%，發(fā)酵時間8 d，SO2添加量80 mg/L。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行性試驗，所釀得的果酒色澤透亮，酒體飽滿，棗香濃郁，口感純正，酒精度15.0%vol，感官評分87分，結(jié)果與預(yù)測值相差較小，研究結(jié)果具有一定的理論和實踐意義。

2.3 青棗果酒香氣成分的GC-MS分析

青棗果酒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分鑒定結(jié)果如圖6和表5，根據(jù)GC-MS結(jié)果分析可知，青棗果酒中分離出的色譜峰中共鑒定出其中21種化合物，占可檢出揮發(fā)性成分總量的99.58%。

表5 青棗果酒香氣成分GC-MS鑒定結(jié)果Table 5 Volatile aroma components of green jujube wine

續(xù)表5 青棗果酒香氣成分GC-MS鑒定結(jié)果Continue table 5 Volatile aroma components of green jujube wine

青棗果酒中的香氣物質(zhì)主要以醇酯類物質(zhì)為主，是酵母等多種微生物共同作用的結(jié)果。醇類化合物是果酒香氣一類重要的化合物，主要是由氨基酸和糖的降解產(chǎn)生[22]。從表5可知，苯乙醇含量最高，通過艾氏途徑，果酒中的L-苯丙氨酸在酶的作用下轉(zhuǎn)化生成苯乙醇[23]。其中相對含量較高的物質(zhì)有苯甲酸芐酯12.91%、鄰苯二甲酸二丙酯8.85%、鄰苯二甲酸二異丁酯6.63%、對羥基苯乙醇3.27%、十六酸2.80%、琥珀酸單乙酯2.40%、油酸1.73%。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化青棗果酒發(fā)酵工藝條件，通過建立模型驗證，表明該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，有一定的實際價值。優(yōu)化后最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度24%，酵母添加量0.3%，在23℃發(fā)酵8 d，SO2的添加量為80 mg/L；在此工藝條件下，得到的青棗果酒酒精度達(dá)15.0%vol，感官評分87分；產(chǎn)品酒體色澤透亮，呈金黃色，酸甜適度，具有令人愉悅的果香和酒香。果酒香氣成分主要包含醇類、酯類、酸類、醛類等，可作為青棗果酒的重要品質(zhì)指標(biāo)，同時為青棗果酒釀造提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。青棗果酒中共鑒定出21種香氣成分，其中相對含量較高的物質(zhì)有：苯乙醇47.84%，對羥基苯乙醇3.27%，苯甲酸芐酯12.91%，鄰苯二甲酸二丙酯8.85%，鄰苯二甲酸二異丁酯6.63%。