異丙酚通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT通路對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、凋亡的影響

李洪軍，余云明，陽(yáng) 興，周 文，李 明

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的45%，發(fā)病隱匿，生長(zhǎng)速度快，因此常規(guī)的手術(shù)及放療等治療手段效果不甚理想，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。腦膠質(zhì)瘤類型為浸潤(rùn)性，主要為低分化的星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星型細(xì)胞瘤3類，以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最為常見(jiàn)。膠質(zhì)瘤與正常腦組織界限不清，因此手術(shù)難以進(jìn)行完全切除；另外，由于其對(duì)放化療并不敏感，因此常在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，不能對(duì)患者起到良好的治療作用，且伴隨的并發(fā)癥會(huì)加重患者痛苦，降低生存質(zhì)量[2]。異丙酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，近年來(lái)研究表明，異丙酚除了良好的麻醉效果外，還有較好的抑癌作用，可能抑制乳腺癌[3]、肝癌[4]等惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。楊陳祎等[5]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)采用不同濃度的異丙酚處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87，從而探討其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況的作用及機(jī)制，以期為異丙酚用于膠質(zhì)瘤治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑與材料 異丙酚購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；結(jié)晶紫、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma公司；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室及Matrigel購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，本研究所使用的抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞解凍、復(fù)蘇后培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。參考Liu等[6]方法，異丙酚溶于培養(yǎng)基后，使其終濃度為0.01、0.02、0.05 mmol/L，將研究細(xì)胞分為空白對(duì)照組(BC組)、P1組(0.01 mmol/L)、P2組(0.02 mmol/L)、P3組(0.05 mmol/L)[7]。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將“1.2.1”項(xiàng)各組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(4×105個(gè)/孔)，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值A(chǔ)(450 nm),細(xì)胞增殖率(%)=(研究組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照孔A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖情況 收集“1.2.1”項(xiàng)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，胰蛋白酶消化、重懸，梯度稀釋后接種至含RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中(1 000個(gè)/皿)，分散均勻后置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，待出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆后，棄去上清，PBS清洗，4%多聚甲多醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，20 min后，洗去染色液，空氣干燥。計(jì)算4組細(xì)胞克隆形成率。克隆形成率=(形成克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 收集“1.2.1”項(xiàng)細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板(5.0×104個(gè)/孔)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，4 ℃離心后重懸，加入PI及Annexin-V-FITC混合均勻，37 ℃反應(yīng)20 min，加入緩沖液，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 將“1.2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板(4×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿底部，利用滅菌槍頭在玻片底部培養(yǎng)基劃痕，PBS沖洗劃下的細(xì)胞，利用含有不同濃度異丙酚的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，記錄0 h、48 h細(xì)胞劃痕寬度。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移率=(研究組劃痕縮小寬度/對(duì)照組劃痕縮小寬度)×100%。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 待“1.2.1”項(xiàng)中各組細(xì)胞消化離心，PBS清洗后重懸，將其以1×105/ml的密度接種于Transwell小室上層，利用含有不同濃度異丙酚的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，下室預(yù)先加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，無(wú)水甲醇固定10 min。結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取6個(gè)視野顯微鏡下拍照(400×)，計(jì)數(shù)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白 收集“1.2.1”項(xiàng)中各組細(xì)胞，提取總蛋白，利用Western blot法檢測(cè)Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase，MMP)9、Caspase-9、3-磷酸肌醇激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、磷酸化-PI3K(p-PI3K)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Protein-serine-threonine kinase，AKT)、磷酸化-AKT(p-AKT)相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 U87細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖率低于BC組(P<0.05)。隨著異丙酚濃度升高，U87細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 平板克隆檢測(cè)結(jié)果 P1、P2、P3組U87細(xì)胞平板克隆形成率低于對(duì)照組(P<0.05)，P3組顯著低于 P1和P2組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

圖2 平板克隆檢測(cè)結(jié)果

2.3 U87細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，隨著異丙酚濃度升高，U87細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 U87細(xì)胞遷移、侵襲檢測(cè)結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，隨著異丙酚濃度升高，U87細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5。

2.5 增殖、凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組細(xì)胞Ki67、MMP-9蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，且隨異丙酚濃度升高，表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)；Caspase-9蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，隨異丙酚濃度升高，表達(dá)量逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

圖4 異丙酚處理后各組U87細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果

2.6 PI3K/ATK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組細(xì)胞p-PI3K、p-ATK蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，且隨異丙酚濃度升高，p-PI3K、p-ATK蛋白表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)；PI3K、ATK蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖5 異丙酚處理后各組U87細(xì)胞侵襲檢測(cè)結(jié)果

圖6 Western blot檢測(cè)增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

目前，膠質(zhì)瘤常用的治療方式為手術(shù)切除，但術(shù)后患者復(fù)發(fā)率較高，且術(shù)后并發(fā)癥極大地增加了患者的痛苦。因此，在圍手術(shù)期減輕患者痛苦的基礎(chǔ)上，有效控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和術(shù)后病情復(fù)發(fā)已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

麻醉藥可在腫瘤切除手術(shù)中緩解疼痛，抑制機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而激活神經(jīng)內(nèi)分泌，抑制自然殺傷細(xì)胞，但同時(shí)也具有抑制免疫功能的作用，因此，近年來(lái)，人們開(kāi)始注意到麻醉藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。異丙酚是腫瘤患者術(shù)中常用的靜脈麻醉藥之一，因其用藥量少，麻醉時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚具有明顯的抗癌作用，可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及miRNA，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[9-10]。Zhang等[11-12]研究結(jié)果表明，1～5 μg/ml的異丙酚可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞、骨肉瘤HOS細(xì)胞系的侵襲能力。在不同腫瘤中，異丙酚可通過(guò)不同作用機(jī)制發(fā)揮作用。有報(bào)道顯示，異丙酚可通過(guò)間接抑制整合素聚集及激動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[11]。另有研究表明，異丙酚可顯著提高肝癌細(xì)胞HepG2中miR-199a表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞侵襲[12]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖率較BC組均顯著降低，隨著異丙酚濃度升高，U87細(xì)胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高，侵襲及遷移能力降低，提示異丙酚可能具有抑癌作用，與Cui等[13]研究結(jié)果一致。

圖7 Western blot檢測(cè)PI3K/ATK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，在癌癥中，該平衡被打破。而細(xì)胞侵襲是癌癥發(fā)生發(fā)展的前提，與腫瘤侵犯周圍組織有關(guān)。PI3K/AKT通路與癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲有關(guān)，PI3K作為原癌基因可激活磷脂酰肌醇及肌醇，可激活下游的Akt，使其磷酸化為p-Akt，進(jìn)而激活或抑制下游基因表達(dá)，參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲[14-16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中p-PI3K、p-ATK蛋白低表達(dá)，PI3K、AKT蛋白無(wú)顯著差異，且呈濃度依賴性，提示異丙酚可能抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中PI3K/AKT通路激活。研究表明，p-AKT可磷酸化Caspase-9基因196位絲氨酸位點(diǎn)，抑制其促凋亡作用[17]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜的完整性，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。王佳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9可能參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而PI3K/AKT通路可能通過(guò)影響MMP-9蛋白表達(dá)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲。Ki67與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是常見(jiàn)的腫瘤增殖標(biāo)志物，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞異常增殖有關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中Ki67、MMP-9蛋白表達(dá)量降低，Caspase-9蛋白高表達(dá)，提示異丙酚可能通過(guò)抑制PI3K/AKT通路激活，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞侵襲能力。

綜上所述，異丙酚可能通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞PI3K/AKT通路激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞侵襲、遷移能力。