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    活血清解湯對急性胰腺炎大鼠的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機制研究

    2020-08-28 08:40:04彭品偉
    實用藥物與臨床 2020年8期
    關(guān)鍵詞:胰腺炎癥血清

    汪 揚,陳 誠,梁 超,彭品偉,陳 騰

    0 引言

    急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種發(fā)生于胰腺內(nèi)的急性炎癥,可導(dǎo)致鄰近器官或其他器官系統(tǒng)的衰竭,其發(fā)病率高,嚴(yán)重危害人們的健康和生活。膽結(jié)石和酒精是AP發(fā)生的主要原因。已有研究證明,活血清解湯能夠通過上調(diào)瘦素及瘦素受體的表達,調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡,阻斷炎癥介質(zhì)的級聯(lián)效應(yīng),從而阻止高脂血癥性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展[1]。本研究采用L-精氨酸腹腔注射誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎大鼠,探討中藥活血清解湯對AP的作用效果,及其對相關(guān)基因的調(diào)控作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SPF級別雄性SD大鼠(200±20) g,購自上海杰思捷實驗動物有限公司。在溫度(26±2)℃,相對濕度50%條件下適應(yīng)1周,自由飲用潔凈自來水(符合上海市飲用水標(biāo)準(zhǔn)),飼喂普通的維持飼料,墊料用輻照后的玉米芯。

    1.2 活血清解湯的制備 采用生大黃15 g,蜜麩炒枳實12 g,芒硝6 g,柴胡12 g,光桃仁12 g,黃連9 g,黃芩9 g,生丹參15 g、赤芍9 g,共99 g,加水熬制,最后制成10袋活血清解湯,每袋160 ml。

    1.3 其他試劑 L-精氨酸:購自上海源葉生物科技有限公司。蘇木精染液和伊紅染液:購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)和RNAiso Plus(Trizol)購自TaKaRa。HO-1一抗和GAPDH抗體購自Proteintech公司;Anti-IL-1β一抗購自Abcam。BCA蛋白測定試劑盒購自于Thermo公司。大鼠IL-6 ELISA試劑盒和大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自ABclonal公司。

    1.4 AP動物模型的制備及分組 參照Tani等[2]和劉大晟等[3]的造模方法,制備大鼠AP模型。實驗前大鼠禁食12 h,自由飲水。大鼠消毒后,采用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射大鼠,劑量為 2.5 g/kg體重,間隔1 h注射1次,共注射2次,構(gòu)建AP模型。注射藥物24 h后,對大鼠進行病理檢查,證實胰腺組織間質(zhì)充血、水腫明顯,并有中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞的浸潤,伴有淡血性腹水即提示造模成功。

    健康SD大鼠被隨機分成3組,每組6只。①空白對照組(C組):以相同方式腹腔注射等體積的生理鹽水,之后灌胃等劑量的生理鹽水。②模型組(M組):腹腔注射L-精氨酸,造模成功后,大鼠灌胃等劑量的生理鹽水。③治療組(T組):腹腔注射L-精氨酸,造模成功后,大鼠灌胃活血清解湯,每次20 ml/kg,每6 h灌胃1次。

    1.5 標(biāo)本采集 于給藥后24 h和36 h,各組大鼠采用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射,麻醉大鼠,抽取大鼠的主動脈血,室溫靜置0.5 h,1 900 g離心10 min,分離得到血清,保存于-80 ℃。同時,收集各組大鼠的胰腺組織,用無菌PBS清洗組織,一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分凍存于-80 ℃,用于后續(xù)分析。

    1.6 觀察指標(biāo)

    1.6.1 病理形態(tài)觀察 將固定24 h的胰腺組織取出,蒸餾水沖洗30 min,去除多余固定液后,進行石蠟包埋、切片,以及蘇木精-伊紅染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。

    1.6.2 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測大鼠胰腺組織中相關(guān)基因的表達 根據(jù)Liu等[4]的方法進行RT-PCR。首先提取胰腺組織中的RNA。取50 mg胰腺組織加入1 ml Trizol。用組織勻漿器勻漿后,加入200 μl氯仿,震蕩均勻后室溫放置2 min,4 ℃、12 000 g離心15 min,取上層水相于另一離心管中。然后加入0.5 ml異丙醇,混勻,4 ℃、12 000 g離心10 min,棄上清。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇溶液,溫和顛倒離心管,4 ℃、7 500 g離心5 min,棄上清,室溫晾干10 min,用20 μl DEPC H2O溶解沉淀,得到RNA。得到的RNA溶液于分光光度計上檢測RNA的純度和濃度。

    根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書,對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR擴增,其引物序列如表1所示,反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環(huán),72 ℃延伸7 min,最后降至4 ℃ 結(jié)束反應(yīng)。其中,GAPDH作為內(nèi)參。

    表1 各基因的引物及引物序列

    1.6.3 免疫組化檢測HO-1和IL-1β的表達 過氧化物酶標(biāo)記的二步法檢測胰腺組織中HO-1和IL-1β的表達。一抗為HO-1(1∶200)和IL-1β(1∶400),二抗為辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)。用DAB顯色液染色1 min,自來水沖洗終止反應(yīng)后,在光學(xué)顯微鏡下觀察。

    1.6.4 Western blot檢測HO-1蛋白和IL-1β蛋白的表達 胰腺組織置于蛋白裂解液中,制備組織勻漿,提取胰腺組織中總蛋白質(zhì)。根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒的制造商說明書,測定所提取樣品的蛋白質(zhì)濃度。取20 μg蛋白進行10% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h后,加入一抗HO-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。洗膜后,加二抗(抗兔,1∶5 000),37 ℃孵育2 h。洗膜后,加入ECL試劑,壓片后,拍照保存。

    1.6.5 ELISA檢測血清中IL-1β和IL-6的水平 按照檢測試劑盒說明書,對大鼠炎癥因子IL-1β和IL-6水平進行測定。

    2 結(jié)果

    2.1 胰腺組織的病理形態(tài) 由圖1可見,空白對照組的胰腺組織結(jié)構(gòu)完整,無細胞水腫,胰管走行正常,未見小葉間間隙增寬,無出血壞死和炎性細胞的浸潤。而模型組在造模24 h后,可見胰腺結(jié)構(gòu)紊亂,彌漫性小葉間水腫,間質(zhì)充血水腫,并伴有炎性細胞的浸潤。然而,在造模36 h后,胰腺組織的損傷進一步加重,有更多的炎性細胞浸潤,腺泡結(jié)構(gòu)破壞伴有血管損傷,腺周圍組織出血壞死。

    圖1 不同組別大鼠胰腺組織的HE染色結(jié)果

    用活血清解湯對造模成功的大鼠治療24 h后,胰腺組織充血水腫較模型組有所減輕,并且炎性細胞浸潤減少。治療36 h后,胰腺組織壞死較少,腺泡結(jié)構(gòu)破壞及血管損傷不明顯,其胰腺炎癥得到一定的改善。

    2.2 RT-PCR結(jié)果 在模型組中,HO-1的表達高于對照組(P<0.05);灌胃活血清解湯后,其表達水平增加(P<0.05),說明活血清解湯可能通過促進HO-1的表達緩解AP。模型組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平升高(P<0.05),活血清解湯給藥處理后,其mRNA表達水平均下降,IL-1β、TNF-α表達水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

    GSTM3在空白對照組和模型組中的相對表達量為27.42±1.51和2.98±2.80,而在治療組中為26.66±5.21,說明在急性胰腺炎大鼠中GSTM3的mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)?;钛褰鉁幚砗?,其表達水平下降,與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RyR的mRNA相對表達量在模型組中為0.07±0.01,而在治療組中,其相對表達量為6.74±0.52,說明活血清解湯可以促進RyR基因的表達,見圖2。

    2.3 HO-1、IL-1β免疫組化和Western blot檢測結(jié)果 模型組胰腺組織中HO-1、IL-1β表達水平高于空白對照組,治療組HO-1表達水平高于空白對照組,而IL-1β表達低于模型組,見圖3。HO-1、IL-1β的Western blot蛋白檢測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示,模型組胰腺組織中HO-1、IL-1β的蛋白表達高于空白對照組,治療組HO-1蛋白表達高于模型組,IL-1β蛋白表達水平低于模型組。

    2.4 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6表達 結(jié)果可知,與對照組相比,模型組中IL-1β[(104.67±22.48) pg/ml]、IL-6[(223.33±64.65) pg/ml]的含量明顯增加,治療組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量分別下降至(90.92±23.83)、(190±72.01)pg/ml。見圖5。

    圖2 HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、GSTM3和RyR基因mRNA水平相對表達量

    圖3 HO-1、IL-1β的免疫組化結(jié)果

    圖4 HO-1、IL-1β的Western blot蛋白檢測結(jié)果

    圖5 ELISA檢測血清中IL-1β和 IL-6的表達

    3 討論

    AP是一種常見的急性腹部疾病,在早期易導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),最終導(dǎo)致多器官功能障礙,死亡率高達15%~20%[5]。在AP炎癥反應(yīng)期間,常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要是促進促炎因子的產(chǎn)生,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),激活 MAPK和NF-κB信號傳導(dǎo)途徑,從而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)放大[6-7]。有許多研究表明,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的改善是緩解AP的主要機制[8-10]。

    近年來,多種應(yīng)激源如缺氧、高熱、創(chuàng)傷等都能誘導(dǎo)HO-1表達,這是機體在應(yīng)激狀態(tài)下的一種適應(yīng)性保護反應(yīng)[8]。HO-1是一種普遍表達的可誘導(dǎo)酶,可將血紅蛋白降解為一氧化碳、聯(lián)肝素和Fe2+,參與維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),并通過減少氧化損傷,抑制細胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng),在保護細胞組織中發(fā)揮重要作用[11]。越來越多的證據(jù)表明,HO-1的過表達可應(yīng)用于多種臨床情況,例如器官移植,急性腎損傷,高血壓和動脈粥樣硬化[12-14]。本研究用活血清解湯治療AP大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),活血清解湯治療后,胰腺組織損傷較模型組顯著減輕。為了進一步探討其機制,本研究用qPCR、免疫組化和Western blot的方法,檢測HO-1在不同組別中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在模型組中,HO-1的表達水平較空白對照組增強,但是用活血清解湯處理后,HO-1的表達水平進一步增加,說明活血清解湯可以通過上調(diào)HO-1的表達來保護胰腺組織,從而緩解急性胰腺炎。

    此外,炎癥反應(yīng)貫穿于AP發(fā)病的全過程,并且體循環(huán)中促炎細胞因子的水平與AP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[15]。IL-1β和IL-6是參與炎癥和免疫反應(yīng)的非常重要的促炎因子;TNF-α是一種多效細胞因子,對急性和慢性胰腺炎的發(fā)展具有非常重要的作用[16-18]。Coelho等[19]研究表明,己酮可可堿可以通過降低促炎因子的水平(IL-6、TNF-α)和增強抗炎因子(IL-10)的表達來緩解AP。本研究檢測了IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及IL-1β蛋白,血清中IL-1β和IL-6的表達情況,結(jié)果均顯示,不管是在胰腺組織還是體內(nèi),這3種促炎因子的水平在模型組中均顯著增強,而經(jīng)過活血清解湯治療后,其水平均有所下降,表明在AP大鼠中,促炎因子顯著表達,而活血清解湯可以通過調(diào)節(jié)促炎因子的水平改善炎癥反應(yīng),緩解AP。

    GSTM3是GSTs超家族一種重要的同工酶。趙明理等[20]通過檢測GSTM3在重癥肌無力患者胸腺組織中的表達,發(fā)現(xiàn)在肌無力患者中,GSTM3的mRNA表達水平顯著增加。在本研究中,在模型組中GSTM3 mRNA表達高于與對照組,而用活血清解湯治療胰腺炎大鼠后,其表達水平有所下降,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RyR是另外一種與氧化應(yīng)激反應(yīng)通路有關(guān)的基因,本研究結(jié)果顯示,在模型組中RyR基因的表達水平顯著下降,而用活血清解湯治療后,其mRNA表達顯著增強,提示活血清解湯可以用過增加RyR基因表達來緩解氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善AP。

    綜上,活血清解湯可以通過上調(diào)HO-1的表達,降低體內(nèi)促炎因子的含量來抑制炎癥反應(yīng),以及上調(diào)RyR基因來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),從而實現(xiàn)對胰腺的保護作用,緩解急性胰腺炎。

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