雷公藤多苷調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路對Graves病小鼠甲狀腺功能和氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用研究

張 潔，王思瑤，陸春暉，羅 荔

0 引言

Graves病又稱為毒性彌漫性甲狀腺腫(Toxic diffuse goiter)，是一種自身免疫性疾病，多數(shù)患者同時(shí)有高代謝癥和甲狀腺腫大，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，可能與環(huán)境因素、精神因素、遺傳因素、病毒及細(xì)菌感染等都有一定的關(guān)系[1-3]。目前，有研究表明，Graves病可能與甲狀腺組織細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR通路的過度激活有關(guān)[2-5]。研究表明，雷公藤多苷具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等作用，對痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病等疾病均有療效[6-8]，同時(shí)，能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤、卵泡修復(fù)等作用[9-11]。本文研究雷公藤多苷對Graves病小鼠甲狀腺功能和氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用及機(jī)制，為Graves病的臨床治療提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BALB/c雌性小鼠60只，SPF(Specific pathogen Free)級別，6周齡，體重18～20 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，購買后進(jìn)行72 h適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。雷公藤多苷購于浙江得恩德制藥有限公司，PI3K、AKT、mTOR和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司，表達(dá)TSHR-A亞單位的重組腺病毒(Ad-TSHR289)購自北京諾賽基因組研究中心有限公司，ELISA檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，ECL顯色液購自Thermo公司，全自動生化分析儀購自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。T3、T4、TRAb ELISA檢測試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2 Graves病小鼠模型的建立及給藥 60只BALB/c小鼠12只作為對照組，其余采用Ad-TSHR 289免疫的方法建立Graves病小鼠模型[12-13]。取Ad-TSHR289 108 IU，用PBS稀釋至50 μl后，脛前肌注，每隔3周1次，共3次，并于第3次免疫完成4周后，通過眼眶后靜脈叢取血，以放射受體分析法測定小鼠血清TSH、TRAb，TRAb陽性同時(shí)伴T4升高、TSH水平降低者視為造模成功。將造模完成后的小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為模型組、雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷中劑量組、雷公藤多苷高劑量組。雷公藤多苷低、中、高劑量組分別灌胃給予小鼠20、40、80 mg/kg雷公藤多苷[14-15]，對照組及模型組灌胃給予小鼠等量生理鹽水，所有組別每天定時(shí)給藥1次，連續(xù)給藥21 d。最后一次給藥結(jié)束24 h后，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組小鼠血清TRAb、T4、T3水平及肝功能指標(biāo)的測定 小鼠通過眼眶靜脈叢取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h，然后置于離心機(jī)中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min。取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠血清TRAb、T4、T3水平，并利用全自動生化分析儀檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)水平。

1.4 小鼠SOD活性、GSH、MDA水平檢測 小鼠處死后，迅速分離肝臟組織，按照SOD活性檢測試劑盒說明書，檢測各組小鼠肝臟SOD活性，參照GSH檢測試劑盒說明書檢測小鼠肝臟GSH水平，按照脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒說明書檢測小鼠肝臟MDA水平。

1.5 各組小鼠甲狀腺組織樣本的采集并計(jì)算甲狀腺臟器指數(shù) 頸椎脫臼處死小鼠后迅速分離甲狀腺組織，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水清洗，除去血液，濾紙吸干表面水分后稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。然后將一部分甲狀腺組織放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機(jī)，以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩ＥK器指數(shù)按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：臟器指數(shù)=甲狀腺濕重(mg)/小鼠體重(g)×100%

1.6 組織病理學(xué)檢查 將在10%中性甲醛中固定24 h后的小鼠甲狀腺組織轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動組織脫水機(jī)脫水、透明處理，在石蠟包埋機(jī)中浸蠟、包埋，進(jìn)行5 μm切片，水浴展開，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規(guī)蘇木精-伊紅染色(E染色)，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟：①脫蠟：將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次，然后把水吸干；③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗2 min，把水吸干；④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水；⑤伊紅染色：置于伊紅溶液中2 min；⑥脫水：依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將凍存的小鼠甲狀腺組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)PI3K、AKT、mTOR、GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤多苷對Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3水平的影響 各組小鼠血清TRAb、T4、T3水平見表1。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷各劑量組小鼠血清TRAb、T4、T3水平均顯著降低(P<0.05)，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

2.2 雷公藤多苷對Graves病小鼠肝功能的保護(hù)作用 各組小鼠血清ALT、AST、ALP水平見表2。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST及ALP水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷各劑量組小鼠血清ALT、AST及ALP水平均顯著降低(P<0.05)。

2.3 雷公藤多苷對Graves病小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響 各組小鼠肝臟組織SOD活性、GSH及MDA水平見表3。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織SOD活性、GSH水平均顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，雷公藤多苷各劑量組小鼠肝臟組織SOD活性、GSH水平均顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

表1 各組小鼠血清TRAb、T4、T3水平(n=6)

表2 各組小鼠血清ALT、AST、ALP水平比較

2.4 雷公藤多苷對Graves病小鼠甲狀腺臟器指數(shù)的影響 各組小鼠甲狀腺臟器指數(shù)見表4。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠甲狀腺臟器指數(shù)顯著升高(P<0.05)，提示造模成功，與模型組相比，雷公藤多苷低、中、高劑量組Graves病小鼠甲狀腺臟器指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，且隨著雷公藤多苷劑量的增加，Graves病小鼠甲狀腺臟器指數(shù)逐漸降低，即表現(xiàn)出劑量依賴性。

2.5 雷公藤多苷對Graves病小鼠甲狀腺組織病理學(xué)的影響 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤，濾泡增生肥大，提示造模成功；與模型組相比，雷公藤多苷低、中劑量組Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞水腫減輕，細(xì)胞排列較整齊，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，雷公藤多苷高劑量組Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞排列整齊，濾泡上皮細(xì)胞增生減輕，偶見炎癥浸潤。

表4 各組小鼠甲狀腺臟器指數(shù)

圖1 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)檢查結(jié)果(200×)

2.6 雷公藤多苷對Graves病小鼠甲狀腺PI3K、AKT、mTOR水平的影響 各組小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR水平見圖2。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷各劑量組Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR水平均顯著降低(P<0.05)，并表現(xiàn)出劑量依賴性。

3 討論

Graves病通常伴有肝臟ALT、AST及ALP等指標(biāo)水平異常的發(fā)生。此外，由于Graves病的全身作用，機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，會造成機(jī)體自由基生成增加或(和)清除能力降低，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)積累而引起氧化應(yīng)激損傷，通常表現(xiàn)為肝臟SOD活性及GSH水平降低、MDA水平升高[16]。雷公藤多苷(Tripterygium glycosides)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤根提取精制而成的一種脂溶性混合物，是一種廣泛使用的抗炎免疫調(diào)節(jié)中草藥提取物，臨床上廣泛用于痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病、腎病綜合征、紫癜性及狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等多種疾病。此外，研究表明，其能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤、卵泡修復(fù)等作用[9-11]。

圖2 各組小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR水平

PI3K/AKT/mTOR通路是一種在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，由調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞存活、細(xì)胞周期進(jìn)程、蛋白質(zhì)翻譯和代謝等多種生理功能的多種細(xì)胞刺激激活。PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活與胃癌、乳腺癌、肺癌等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[17-19]。有研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的過度激活與Graves病的發(fā)病機(jī)制存在一定的關(guān)系[2-5]。

本文采用Ad-TSHR 289免疫的方法建立Graves病小鼠模型，研究不同劑量的雷公藤多苷對Graves病小鼠的作用及其對甲狀腺組織PI3K/AKT/mTOR通路的影響。結(jié)果表明，雷公藤多苷能夠呈劑量依賴性地降低Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3、ALT、AST及ALP水平，提高小鼠肝臟組織SOD活性及GSH水平，降低肝臟MDA水平，并能夠顯著降低Graves病小鼠甲狀腺臟器指數(shù)，改善小鼠甲狀腺組織病理學(xué)狀態(tài)，降低Graves病引起的小鼠氧化應(yīng)激損傷，緩解疾病狀態(tài)，改善疾病進(jìn)展及預(yù)后。此外，雷公藤多苷能夠呈劑量依賴性降低Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR水平，從而抑制Graves病小鼠甲狀腺組織細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的異常激活，進(jìn)而緩解Graves病小鼠的疾病進(jìn)展，改善疾病轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，雷公藤多苷能夠改善Graves病小鼠甲狀腺功能、氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而緩解由此引發(fā)的肝臟損傷的一系列并發(fā)癥，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)。