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    重組人Dickkopf相關(guān)蛋白1在氟化鈉所致PC12細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制

    2020-08-28 08:40:00岳蘇陽(yáng)李慧華
    實(shí)用藥物與臨床 2020年8期
    關(guān)鍵詞:氟化物神經(jīng)元培養(yǎng)基

    岳蘇陽(yáng),丁 欽,李慧華,陳 銳*

    0 引言

    氟化物廣泛存在于自然界和日常生活中,目前正成為一種不可避免的環(huán)境污染物,其能夠引起海馬神經(jīng)元損傷、影響神經(jīng)再生以及突觸可塑性。有研究表明,氟化物的細(xì)胞毒性與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、DNA和RNA的一般變化以及蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)[1]。長(zhǎng)期暴露會(huì)導(dǎo)致氟中毒和不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷,并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,損害神經(jīng)發(fā)生、突觸的可塑性以及突觸的功能,破壞突觸相關(guān)蛋白的表達(dá),導(dǎo)致大腦皮層微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、突觸素(SYP)和發(fā)育受調(diào)節(jié)的腦蛋白(Dbn)在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)明顯降低,氟化物介導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙的減少可能是由于這些突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的破壞,導(dǎo)致神經(jīng)元功能減弱而引起[2-3]。有研究表明,Wnt信號(hào)通路參與了暴露于氟化物的PC-12細(xì)胞的抗增殖過(guò)程,DDK1則能夠減弱PC-12細(xì)胞中氟化物的抗增殖活性[4]。此外,氟化物可通過(guò)JNK和Wnt信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞增殖。

    Dickkopf-1 (DKK-1)在體內(nèi)參與了許多病理生理過(guò)程,其異常表達(dá)不僅會(huì)改變典型Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)蛋白和基因的表達(dá),還會(huì)改變其他信號(hào)通路中相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。以往對(duì)DKK-1的研究主要集中在其在腫瘤中的作用,近年大量研究表明,其在胚胎發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸形成等方面發(fā)揮著重要作用,因此,DKK-1在神經(jīng)發(fā)育不良、認(rèn)知功能障礙、情緒障礙等神經(jīng)精神疾病中的作用越來(lái)越受到人們的重視[5]。DKK-1作為調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負(fù)性因子,在正常腦組織中很少表達(dá),但是DKK-1在發(fā)生神經(jīng)元凋亡的腦組織中高表達(dá),提示DKK-1可能參與了神經(jīng)元凋亡的過(guò)程[6]。DKK-1在許多腫瘤中低表達(dá),但在部分腫瘤中高表達(dá),越來(lái)越多的證據(jù)表明,DKK-1在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著復(fù)雜而不同的作用[7]。因此,筆者提出設(shè)想,DKK-1可通過(guò)誘導(dǎo)氟中毒神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,抑制神經(jīng)再生,從而改變認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞給予氟化鈉處理,觀(guān)察PC12細(xì)胞的增殖、凋亡情況以及DKK-1、β-catenin的表達(dá)變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料 PC12細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所,NaF購(gòu)自德國(guó)耶拿生物科學(xué)公司,RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gemini公司,蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin V FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自徐州博立達(dá)生物科技有限公司,CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所,DKK-1、β-catenin兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,actin鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS、雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基,將PC12細(xì)胞接種到半徑5 cm的培養(yǎng)皿中,置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%~80%后,用胰蛋白酶EDTA消化液加以消化細(xì)胞,按1∶3予以分皿傳代。

    1.2.2 CCK-8檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞增殖率 細(xì)胞以5×103/孔密度接種到96孔板中,待細(xì)胞貼壁后加入2 000 μM NaF,干預(yù)0、6、12、24、48 h。每組設(shè)置了6個(gè)副孔。吸除培養(yǎng)基,用37 ℃ PBS洗2次,每孔加入100 μl用培養(yǎng)基配制的10%CCK-8液體,在37 ℃、5%CO2條件下培育1 h,并使用450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

    1.2.3 Western blot方法檢測(cè)DKK-1與β-catenin蛋白表達(dá)水平 按照“1.2.2”所示分組,2 000 μM NaF干預(yù),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟予以提取蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,牛奶室溫封閉2 h,1抗4 ℃孵育過(guò)夜,Washing buffer清洗5 min×3次,熒光2抗室溫孵育2 h,Washing buffer清洗5 min×3次,Odyssey紅外激光成像,Image J軟件分析灰度值。

    1.2.4 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h,用胰蛋白酶處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×106個(gè)細(xì)胞/15 ml,重新接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染;向滅菌離心管中加入無(wú)雙抗培養(yǎng)基與病毒液(10 μl n-siRNA、10 μl Dkk1-siRNA),調(diào)整總體積為6 ml,混勻后,給細(xì)胞換液,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基,加入2 ml PBS液清洗2次,輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)皿以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物后倒棄;然后緩慢加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基6 ml,于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,于熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染情況,若效果較好,則予以提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測(cè)DKK-1干擾效果。轉(zhuǎn)染成功后加入NaF藥物干預(yù),檢測(cè)Wnt/β-catenin通路蛋白變化。依據(jù)說(shuō)明書(shū),運(yùn)用Annexin V FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    2 結(jié)果

    2.1 NaF對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響 光鏡下觀(guān)察,對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好,細(xì)胞呈梭形,向外突起明顯。細(xì)胞經(jīng)NaF損傷后,細(xì)胞皺縮,突起變短,部分細(xì)胞甚至脫落。CCK-8結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,氟化鈉藥物組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖1。

    圖1 NaF對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

    *P<0.05,**P<0.01

    2.2 NaF對(duì)DKK-1蛋白表達(dá)的影響 Western blot方法檢測(cè)NaF對(duì)DKK-1蛋白表達(dá)的影響,與對(duì)照組比較,NaF損傷24 h和48 h后,DKK-1蛋白的表達(dá)隨著NaF損傷時(shí)間的增加而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

    圖2 Western blot方法檢測(cè)NaF損傷后細(xì)胞中DKK-1蛋白表達(dá)

    2.3 轉(zhuǎn)染 熒光顯微鏡下觀(guān)察空載病毒(n-siRNA)與DKK-1干擾病毒(DKK-1-siRNA)轉(zhuǎn)染情況,WB方法結(jié)果提示DKK-1干擾效果較好(圖3)。

    圖3 DKK-1-siRNA與n-siRNA干擾結(jié)果對(duì)比

    2.4 DKK-1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 與n-siRNA對(duì)比,NaF組DKK-1蛋白表達(dá)明顯升高,β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與n-siRNA+NaF組對(duì)比,DKK-1-siRNA組DKK-1蛋白表達(dá)降低,β-catenin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

    2.5 DKK-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與n-siRNA對(duì)比,n-siRNA+NaF組細(xì)胞凋亡增多。與n-siRNA+NaF組對(duì)比,DKK-1-siRNA組細(xì)胞凋亡減少。見(jiàn)圖5。

    3 討論

    流行病學(xué)研究報(bào)告顯示,高氟化飲用水可能會(huì)顯著降低接觸兒童的智商(IQ)。有報(bào)道,突觸可塑性是發(fā)展兒童的學(xué)習(xí)和記憶技能的基礎(chǔ)[8]。氟化物暴露與智商的關(guān)系呈分段線(xiàn)性關(guān)系,具有閾值和飽和效應(yīng),而適度過(guò)量氟化物暴露主要與優(yōu)秀智力的喪失有關(guān)[9]。

    過(guò)量氟化物暴露導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、智力受損主要有以下機(jī)制:①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷:一定劑量的NaF可以導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,其中過(guò)量的氟產(chǎn)生了過(guò)量的ROS,誘導(dǎo)神經(jīng)元中過(guò)度的氧化應(yīng)激和ERS,加劇了神經(jīng)元的凋亡,并且在細(xì)胞凋亡水平與細(xì)胞內(nèi)ROS水平之間呈線(xiàn)性關(guān)系,最后導(dǎo)致?lián)p傷[10]。②JNK途徑:高劑量的NaF通過(guò)半胱天冬酶介導(dǎo)但不依賴(lài)ROS的途徑中的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致hESC死亡,并伴隨著磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)水平的增加。用p-JNK特異性抑制劑(SP600125)進(jìn)行預(yù)處理可以以濃度和時(shí)間依賴(lài)性方式有效保護(hù)hESC免受NaF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11]。③Fas-L途徑:在一定的研究條件下,F(xiàn)as-L依賴(lài)性信號(hào)通路被激活,進(jìn)而使得NaF誘導(dǎo)了低水平的細(xì)胞凋亡[12]。④Wnt/β-catenin 信號(hào)通路:氟能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin 途徑,并改變相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞中β-catenin蛋白的位置,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[13]。⑤M1和M3毒蕈堿型乙酰膽堿受體的表達(dá)水平:慢性氟中毒大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙的機(jī)制可能與mAChRs中M1和M3表達(dá)的降低有關(guān)[14]。⑥氟化物對(duì)某些神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變及其神經(jīng)毒性:氟化物含量的增加導(dǎo)致某些神經(jīng)遞質(zhì)(如腎上腺素、組胺、5-羥色胺和谷氨酸鹽)的水平升高,而去甲腎上腺素、乙酰膽堿和多巴胺的水平呈劑量依賴(lài)性降低。同時(shí),脂質(zhì)過(guò)氧化作用顯著增加,抗氧化防御系統(tǒng)受損。研究結(jié)果表明高劑量的NaF對(duì)神經(jīng)有毒性作用[15]。考慮到氟化物可通過(guò)JNK和Wnt信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞增殖,隨著 Wnt信號(hào)通路的活化,氟暴露水平的增加,GSK3β、β-catenin含量以及DKK-1、GSK3β、β-catenin 的異常檢出率逐漸增加,但 DKK-1 含量顯著降低[16-17]。DKK-1作為調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負(fù)性因子,在正常腦組織中很少表達(dá),但其在發(fā)生神經(jīng)元凋亡的腦組織中高表達(dá),提示DKK-1可能參與了神經(jīng)元凋亡的過(guò)程[8]。

    圖4 DKK-1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

    圖5 DKK-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

    Dickkopf(DKK)家族由脊椎動(dòng)物中的4個(gè)分泌蛋白組成(DKK 1、2、3、4),是Wnt信號(hào)通路最關(guān)鍵的拮抗劑家族之一,其中DKK-1主要通過(guò)與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/LRP6)受體及Kremen-1/2結(jié)合成復(fù)合物而阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)[18-19]。DKK-1是信號(hào)通路Wnt/β-catenin通路的抑制劑,在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著相互矛盾的作用,既可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的癌基因啟動(dòng)子,也可以作為腫瘤抑制子,DKK-1可以通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境和誘導(dǎo)炎癥,促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[20]。

    Wnt信號(hào)傳導(dǎo)異常與幾種疾病有關(guān),例如AD、癲癇、代謝性疾病等。其中阿爾茨海默氏病(AD)是老年性癡呆的最常見(jiàn)形式,其特征是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積在特定的大腦區(qū)域,由Aβ誘導(dǎo)的Wnt信號(hào)的下調(diào)與AD的疾病進(jìn)展有關(guān)。此外,越來(lái)越多的證據(jù)支持Wnt信號(hào)在胚胎發(fā)育過(guò)程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育以及成年大腦的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。更重要的是,通過(guò)Wnt配體持續(xù)激活Wnt信號(hào),或抑制Wnt信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)劑,例如在疾病中活躍的DKK-1和GSK-3β,能夠降低Aβ毒性并改善AD的認(rèn)知能力[21]。因此,Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK-1也可能通過(guò)影響神經(jīng)干細(xì)胞的再生,引起氟中毒所致的認(rèn)知功能障礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NaF會(huì)影響細(xì)胞的活性,降低其增殖能力,并且隨著NaF干預(yù)時(shí)間的增加,DKK-1蛋白的表達(dá)水平也隨之增高。此外,DKK-1還與細(xì)胞凋亡之間存在密切聯(lián)系,通過(guò)阻斷Wnt /β-catenin途徑能夠促進(jìn)Eca109細(xì)胞的凋亡[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn),DKK-1表達(dá)的降低,使得Wnt /β-catenin信號(hào)通路激活,進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。反之,DKK-1的異位表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖,或通過(guò)凋亡增強(qiáng)因子誘導(dǎo)凋亡[24]。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),NaF能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡,反之,干擾DKK-1的表達(dá)后,Wnt/β-catenin信號(hào)通路重新激活,細(xì)胞凋亡減少。

    綜上所述,DKK-1能促進(jìn)氟化鈉導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞PC-12凋亡,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮作用。明確DKK-1在氟中毒所致認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制,將為氟中毒所致認(rèn)知功能障礙的后續(xù)治療和及早干預(yù)提供新的可能策略,也能夠?yàn)榻窈蟀邢蛩幬锏难邪l(fā)提供理論參考依據(jù)。

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