硫酸乙酰肝素在哺乳動(dòng)物肺發(fā)育中的功能

陳婭萍 陸紫云 宋雙 張婷 張?zhí)焯? 崔浩

摘要：在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，哺乳動(dòng)物肺發(fā)育經(jīng)歷了氣管分支形態(tài)發(fā)生、上皮管道形成、血管生成、肺泡分化等過(guò)程。這些過(guò)程受到各種激素、生長(zhǎng)因子以及形態(tài)發(fā)生素等蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）是一類高度異質(zhì)性的帶負(fù)電荷的大分子糖胺聚糖，其主要位于細(xì)胞表面以及細(xì)胞間質(zhì)中。HS通過(guò)與蛋白相互作用參與哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程。多年來(lái)，大量研究工作表明，HS與多種生長(zhǎng)因子、趨化因子、形態(tài)發(fā)生素等蛋白結(jié)合后參與肺發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。本文根據(jù)目前最新的研究進(jìn)展，闡述了HS糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)與肺發(fā)育過(guò)程的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：硫酸乙酰肝素;哺乳動(dòng)物肺發(fā)育;功能

一、哺乳動(dòng)物肺發(fā)育

從胚胎發(fā)育成為具有自主呼吸能力的新生兒是哺乳動(dòng)物如人類發(fā)育的重要過(guò)程。在子宮內(nèi)，胚胎肺部血流量低，氧合作用主要通過(guò)胎盤的氣體交換完成。出生后，新生兒心血管循環(huán)模式發(fā)生改變，肺部血流量大幅增高，從而代替胎盤進(jìn)行氣體交換。然而，如果肺部發(fā)育不成熟或肺部發(fā)生損傷，可造成肺泡表面積減少，肺血流供應(yīng)不足，導(dǎo)致氣體交換功能受損和新生兒呼吸衰竭的發(fā)生[1]。

哺乳動(dòng)物肺首先從內(nèi)胚層前腸以上皮肺芽的形式出現(xiàn)。原始的肺芽不斷生長(zhǎng)延伸到周圍間質(zhì)中，形成相互連通的各級(jí)氣管并在細(xì)支氣管末端形成短管束。短管束進(jìn)一步分支后擴(kuò)展形成終末導(dǎo)管，與此同時(shí)肺泡和血管開始發(fā)育，終末導(dǎo)管進(jìn)一步擴(kuò)大構(gòu)成原始肺泡。原始肺泡分隔和重建后，肺泡數(shù)量和表面積大幅增加，形成成熟的肺泡[2]。大量研究表明肺分支形成過(guò)程中，上皮與間充質(zhì)之間的相互作用至關(guān)重要，肺上皮生長(zhǎng)和分化受到發(fā)自間充質(zhì)的信號(hào)的調(diào)控。在此過(guò)程中，相關(guān)基因的表達(dá)受到各種轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子的時(shí)空調(diào)控[3]。

二、硫酸乙酰肝素

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS），是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含有硫酸基團(tuán)的帶負(fù)電荷的糖胺聚糖。HS與核心蛋白共價(jià)結(jié)合形成蛋白聚糖（proteoglycan）（如Syndycans，Glypicans和Perlecan等），廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中。大量研究顯示，HS糖鏈可與上百種蛋白如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等相互結(jié)合，參與胚胎發(fā)育，正常生理平衡以及老年癡呆、病毒感染、炎癥、腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。HS與各種蛋白結(jié)合的能力與其糖鏈的精細(xì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[4]。

HS糖鏈的生物合成是通過(guò)多達(dá)20多種催化酶在高爾基體內(nèi)對(duì)底物的協(xié)調(diào)加工完成的。首先，特征四糖片段（GlcAGalGalXyl）在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下與核心蛋白的絲氨酸（Ser）殘基連接。而后，聚合酶EXT1/EXT2催化延伸HS糖鏈形成由[GlcAβ1，4GlcNAcα1，4]二糖重復(fù)單元組成的骨架糖鏈。最后經(jīng)過(guò)一系列的修飾反應(yīng)，包括GlcNAc的N去乙酰N硫酸化（NDST），GlcA差向異構(gòu)化為IdoA（HSepi），己糖醛酸C2位的硫酸化（2OST），以及葡萄糖胺的C6位（6OST）和C3位（3OST）的硫酸化。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種NDST同工酶，3種6OST和7種3OST，1種HSepi和2OST，參與人體細(xì)胞HS糖鏈的修飾。HS糖鏈的修飾反應(yīng)具有一定的時(shí)序性，例如，起始修飾階段，關(guān)鍵酶NDST對(duì)GlcNAc進(jìn)行N脫乙酰N硫酸化形成N硫酸化結(jié)構(gòu)域后才能夠被C5差向異構(gòu)化和O硫酸化修飾[4]。

三、HS糖鏈結(jié)構(gòu)高度多樣化

HS生物合成的復(fù)雜性決定了其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的多樣性，這些HS糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的差異是由于參與HS合成的酶的表達(dá)譜在不同生理或病理狀態(tài)（如組織/細(xì)胞類型、分化、生長(zhǎng)或病理狀態(tài)）下的差異決定的。例如在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，HS糖鏈存在發(fā)育階段和組織特異性的結(jié)構(gòu)改變。未分化的胚胎干細(xì)胞顯示低硫酸化修飾的HS結(jié)構(gòu)，而分化的神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)較高硫酸化的HS，其中糖鏈的N和6O硫酸化修飾程度顯著提高。研究顯示，在小鼠大腦胚胎發(fā)育過(guò)程中，HS糖鏈的鏈長(zhǎng)和硫酸化修飾模式呈動(dòng)態(tài)變化[5]。

四、HS糖鏈在肺發(fā)育中的作用

肺發(fā)育過(guò)程中，大量細(xì)胞生長(zhǎng)因子、形態(tài)發(fā)生素等蛋白通過(guò)介導(dǎo)上皮間充質(zhì)相互作用，從而誘導(dǎo)上皮分化和促進(jìn)肺間充質(zhì)的增殖、分化和模式化。研究顯示，HS糖鏈通過(guò)與這些蛋白因子相互結(jié)合，調(diào)節(jié)其運(yùn)輸過(guò)程或生物活性，從而參與肺部發(fā)育。HS糖鏈修飾酶發(fā)生突變可導(dǎo)致肺發(fā)育缺陷。例如，NDST1基因敲除小鼠表現(xiàn)嚴(yán)重的腦部、面部、眼睛和骨骼發(fā)育異常，突變小鼠出生后迅速死于肺功能不全。進(jìn)一步研究顯示，敲除NDST1基因可導(dǎo)致肺泡間隔增厚以及II型肺細(xì)胞成熟障礙（分泌表面活性蛋白以啟動(dòng)和維持肺泡擴(kuò)張）。在果蠅中，NDST1同源物sulfateless突變可引起氣道發(fā)育障礙。機(jī)理研究表明，sulfateless突變顯著降低了FGF誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路活性，從而導(dǎo)致氣管細(xì)胞遷移和分支形態(tài)發(fā)生缺陷。我們的研究結(jié)果表明，敲除C5差向異構(gòu)酶基因HSepi后，細(xì)胞合成的HS糖鏈僅含有GlcA而不含IdoA。HSepi敲除小鼠具有腎臟發(fā)育不全、骨骼畸形、眼睛發(fā)育缺陷和肺發(fā)育不成熟等表型，出生后由于呼吸窘迫而死亡。HS糖鏈6O硫酸化修飾在氣管發(fā)育中同樣重要，利用RNAi抑制果蠅6OST表達(dá)可降低FGF誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路活性，導(dǎo)致氣管分支障礙和胚胎死亡。然而，在小鼠模型中，敲除6OST1基因?qū)π∈笈咛シ伟l(fā)育或分支形態(tài)發(fā)生沒(méi)有影響，但小鼠出生后，表現(xiàn)肺泡發(fā)育缺陷、肺泡體積和不規(guī)則彈性蛋白沉積增加等癥狀[6，7]。

利用胚胎肺組織塊體外培養(yǎng)模型，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室證明了HS糖鏈在肺形態(tài)發(fā)生中的重要功能。利用肝素酶裂解E11.5小鼠上皮組織塊中（無(wú)間充質(zhì)）的HS糖鏈可致其迅速死亡，而未添加FGF10生長(zhǎng)因子培養(yǎng)的肺可導(dǎo)致類似現(xiàn)象，這表明去除HS糖鏈可能破壞了FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而導(dǎo)致肺發(fā)育障礙。與此呼應(yīng)，研究顯示，在E11E13胚胎小鼠肺中，F(xiàn)GF10蛋白的表達(dá)與肺分支活躍區(qū)域中HS糖鏈表達(dá)相關(guān)。此外，在肺上皮細(xì)胞或全肺組織塊培養(yǎng)基中添加肝素可改變FGFs誘導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生的活性。體外肺組織塊培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量肝素可一定程度上增強(qiáng)上皮分枝。而高濃度肝素處理可同時(shí)調(diào)控支氣管平滑肌細(xì)胞分布和分支形態(tài)發(fā)生。同樣利用肺組織塊體外培養(yǎng)模型，通過(guò)氯酸鈉抑制HS糖鏈硫酸化或在培養(yǎng)基添加過(guò)量的O硫酸化肝素可干擾FGF10與上皮細(xì)胞結(jié)合以及FGF10的生物活性，最終抑制BMP4的表達(dá)和阻礙肺分支的形成。此外，向氯酸鈉處理的肺組織塊培養(yǎng)基中添加僅含N硫酸化修飾的肝素（去O硫酸化）不能恢復(fù)FGF依賴的生存和生長(zhǎng)，而添加過(guò)量或部分O硫酸化修飾的肝素可以修復(fù)氯酸鈉處理導(dǎo)致的肺分支障礙。這些證據(jù)表明O硫酸化修飾對(duì)HS糖鏈參與肺部的發(fā)育至關(guān)重要[6，7]。

五、結(jié)語(yǔ)

HS糖鏈通過(guò)儲(chǔ)存或聚集各種生長(zhǎng)因子以及充當(dāng)受體或輔助受體等多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與分支器官特別是肺發(fā)育的過(guò)程。HS的調(diào)節(jié)功能受到其糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。因此，闡明HS糖鏈結(jié)構(gòu)與肺部發(fā)育關(guān)系可為靶向生長(zhǎng)因子或者細(xì)胞層面的肺組織再生和修復(fù)研究提供重要參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kinsella，J.P.，A.Greenough，and S.H.Abman，Bronchopulmonary dysplasia.Lancet，2006，367（9520）：14211431.

[2]Metzger，R.J.，et al.，The branching programme of mouse lung development.Nature，2008，453（7196）：745U1.

[3]Warburton，D.，Developmental biologyOrder in the lung.Nature，2008，453（7196）：733735.

[4]J.P.Li，M.K.G.，Heparan Sulfate Biosynthesis，Structure，and Function International Review of Cell and Molecular Biology，2016，325：215273.

[5]Poulain，F(xiàn).E.and H.J.Yost，Heparan sulfate proteoglycans：a sugar code for vertebrate development？ Development，2015，142（20）：345667.

[6]Patel，V.N.，D.L.Pineda，and M.P.Hoffman，The function of heparan sulfate during branching morphogenesis.Matrix Biol，2016.

[7]Thompson，S.M.，et al.Heparan sulfate in lung morphogenesis：The elephant in the room.Birth Defects Res C Embryo Today，2010，90（1）：3244.

基金項(xiàng)目：2018年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201810414010）

作者簡(jiǎn)介：陳婭萍（2000—），女，漢族，湖南耒陽(yáng)人，本科，研究方向：糖生物學(xué)。

*通訊作者：崔浩（1985—），男，漢族，江蘇人，博士，副教授，研究方向：糖生物學(xué)。