稀有細胞群單細胞分選方案的優(yōu)化

宋興輝，李艷偉，王佳佳，邢月婷，黃瑩瑩，郭春

（浙江大學，浙江杭州 310058）

用于細胞分離、純化的技術(shù)包括流式細胞分選技術(shù)、磁珠分選、重力沉降、密度梯度離心等，其中流式細胞分選技術(shù)具有不可替代性，因為其具有以下9個特點：（1）可以根據(jù)多個細胞參數(shù)（多種顏色的熒光標記）來分選細胞群；（2）可以根據(jù)表面蛋白的密度差異（即同一信號的強弱差異）來分類分離細胞；（3）可以分離低密度表面抗原（即微弱信號）的細胞；（4）可以得到95%～100%極高純度的目標細胞群（5）可以根據(jù)細胞功能活動及狀態(tài)特征來分選細胞，如非抗體標記的胞吞、調(diào)亡等；（6）可以根據(jù)細胞內(nèi)的某些標志，如DNA含量、熒光蛋白、胞內(nèi)抗原等分離細胞；（7）可以分選含量極低的稀有細胞（如0.001%或更低）；（8）可以分選感興趣的未知特征的細胞亞群；（9）可以進行多孔板分選，如單克隆分選，在96、384、1536孔板每個孔中精確地分入1個細胞。

隨著科學研究的進一步深入，精準到單個細胞的研究日益增加，分離得到目標單細胞成為這一研究中不可或缺的部分，而流式細胞分選則是其中的一項關鍵技術(shù)。本研究基于分選極低含量的稀有細胞和進行多孔板分選的實驗目的和實驗需求，對分選分案進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器

moflo AstriosEQ超高速分選儀，，美國貝克曼庫爾特有限公司。分選選用100 nm噴嘴，鞘液壓力30 psi（約207 kPa），與樣品壓力的差為0.3 psi（約2 kPa），分選模式選擇單細胞（single）模式，液滴信封選擇0.5。首先利用校正微球調(diào)節(jié)儀器光路并執(zhí)行光路質(zhì)量檢測（QC），QC通過后，調(diào)節(jié)液路找到最佳液滴延遲值，在不對目標細胞加電的模式（SD）下通過調(diào)節(jié)cyclone校準液滴滴落在孔板每個孔上的位置，以備下面的分選實驗。

1.2 實驗方案

1.2.1 細胞準備

為了滿足稀有細胞的要求，染色細胞和未染色細胞按1∶100的比例，即1%的陽性比例。細胞采用jurkat細胞，染色方法采用CFSE活細胞染料，按照1∶1 000染色5 min后，離心去除染料，PBS重懸后計數(shù)，與未染色細胞按照1∶100混合后得到1%陽性率的細胞懸液，待分選。

1.2.2 分選方案

（1）如圖1a所示，畫線性點圖，圈定細胞群，確定細胞群體位置；（2）如圖1b～1d所示，畫線性圖，以對角線畫門，去除細胞懸液中的粘連細胞；（3）如圖1e所示，畫對數(shù)點圖，圈定陽性細胞群。設置分選的門邏輯關系為細胞群&三次去粘連&陽性細胞群。找到目標細胞群后，先運行1 min左右讓液流穩(wěn)定住，然后進行96孔板分選，每孔設定1個細胞。96孔板中預先在每一個孔中加200 μL細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為1640培養(yǎng)基，10%血清和1%雙抗，共分選3塊96孔板。將分選后的96孔板放置于含5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，7 d后，置于顯微鏡下觀察，確定生成的單細胞克隆數(shù)，計算分選效率。

圖1 分選方案

2 結(jié)果與分析

通過流式分析的方法找到細胞群如圖2a所示，分析出陽性細胞，并分選至96孔板的每個孔中。7 d以后顯微鏡下觀察，找到如圖2b中的細胞克隆計數(shù)并統(tǒng)計。3塊孔板形成的單克隆數(shù)分別為88、82和79個，分選并能夠形成單細胞克隆的平均得率為86.5%。

圖2 細胞懸液中的活細胞群體及培養(yǎng)7 d后形成的單克隆

較多文獻中報道了[1-2]驗證單細胞分選得率的方案，但均局限于分選前期，即僅判定是否分至細胞培養(yǎng)板的孔中，而此次實驗延伸至分選末期，不僅將單個細胞分選至單個孔中，還可以形成單克隆，采用的單細胞分選優(yōu)化方案利用單克隆的形成率更加準確地說明了單細胞分選的效率。單細胞分選實驗中影響后期單細胞成活率或單克隆形成率的主要因素可歸納為以下4點。

（1）儀器光路和液路的精確性，尤其是液滴延遲的準確性。光路的校正主要依靠QC校正微球，通過調(diào)節(jié)光路，使QC驗證通過，即可使儀器光路處于最佳工作狀態(tài)，而液路的調(diào)節(jié)即液滴延遲的調(diào)節(jié)，則更多地依靠儀器操作人員的經(jīng)驗。

（2）液滴降落的位置準確。流式細胞分選的原理是通過對目標細胞加電，然后在電極板的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，降落至收集容器中。由于液滴有一定的偏轉(zhuǎn)角度，所以這給孔板分選時校正液滴降落位置帶來很多困難，有些研究者通過增加液滴數(shù)目，預分選后確定液滴降落位置，然后再進行分選實驗。本實驗采用的是不對目標細胞加電而是對中心液流加電偏轉(zhuǎn)的模式。在這個模式中，目標細胞的降落方式為垂直降落，沒有偏轉(zhuǎn)角度，所以可以較為容易地準確定位液滴降落位置。

（3）細胞活性。分選后的細胞活性對很多分選下游實驗影響很大，尤其是單細胞分選實驗。分選后的細胞活性很大程度上取決于分選前細胞活性，所以對分選后細胞活性要求高的實驗，必須確保分選前細胞的活性。

（4）溫度，包括待分選細胞懸液的存儲溫度和分選時溫度。細胞一旦離開最佳生長環(huán)境，低溫（4 ℃）是保持細胞最佳狀態(tài)的重要條件。所以在進行分選實驗時，必須將細胞始終保持在低溫狀態(tài)下，才能使細胞有較高的活性，保證后續(xù)的存活率和單克隆形成率。

3 結(jié)論

本文通過對儀器光路和液路進行精準調(diào)節(jié),準確確定液滴降落的位置,確保分選前細胞的活性,獲得單細胞分選的優(yōu)化方案,在此方案下單細胞克隆形成率達86.5%。