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    基于高通量靶向測(cè)序的大鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)方案建立

    2020-08-27 06:40:56徐園錢(qián)強(qiáng)鮑世民肖君華李凱
    生物化工 2020年4期
    關(guān)鍵詞:建庫(kù)高通量分型

    徐園,錢(qián)強(qiáng),鮑世民,肖君華,李凱*

    (1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 2016202;2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,上海 200031)

    近交系與封閉群大鼠作為重要的動(dòng)物模型,在臨床前藥物實(shí)驗(yàn)、毒理實(shí)驗(yàn)等科研工作中起著愈來(lái)愈重要的作用[1]。但是大鼠經(jīng)過(guò)多年繁育,群間遺傳分化嚴(yán)重,使試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性大大降低,急需對(duì)大鼠建立遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)遺傳監(jiān)測(cè)手段保持其遺傳穩(wěn)定性[2]。商海濤等[3]用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析北京和上海兩家單位的Wistar和SD大鼠,結(jié)果表明各群體的遺傳多樣性保持良好,但群間遺傳差距較大。

    目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的研究較多,而對(duì)大鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)研究較少。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)方法主要是以近交系小鼠和大鼠為基礎(chǔ)建立起來(lái)的,常用的方法主要包括毛色基因檢測(cè)法、生化標(biāo)記基因檢測(cè)法、免疫標(biāo)記基因檢測(cè)法、下頜骨形態(tài)測(cè)量分析法以及分子標(biāo)記檢測(cè)法[4]。傳統(tǒng)方法的操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且耗費(fèi)大量的人力物力,亟待找到一種簡(jiǎn)便、快速且價(jià)格低廉的方法來(lái)滿(mǎn)足目前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳品質(zhì)越來(lái)越高的要求。

    基于多重PCR的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型方案,是一種高通量與高特異性的SNP分型方案[5]。本研究在PCR-LDR(連接酶檢測(cè)反應(yīng))技術(shù)的SNP分型方案用于小鼠遺傳鑒定的基礎(chǔ)上[6],將同樣的方法運(yùn)用于大鼠,篩選出大鼠染色體上均勻分布的90個(gè)SNP位點(diǎn),并采用靶向建庫(kù)測(cè)序技術(shù),以期實(shí)現(xiàn)大鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)的高通量SNP分型方案。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選取來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SYXK(滬)2007-0005)SHR、WKY、GK、F344共 4個(gè)近交系及SD封閉群大鼠,數(shù)量分別為9只、7只、4只、8只和7只,共35只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。收集這些大鼠尾巴1 cm左右,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要儀器和試劑

    A-100 PCR儀,購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;Gene Amp PCR system 9600 PCR儀,購(gòu)自美國(guó)Norwalk公司;JY600+電泳儀,購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;FR-200A全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置、生物電泳圖像分析系統(tǒng),均購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司。

    PCR引物(PAGE純化)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;dNTP(promega)購(gòu)自上海有漁生物工程有限公司;Taq酶體系和ddH2O為實(shí)驗(yàn)室自制。

    1.3 SNP位點(diǎn)選取

    如圖1所示,挑選的SNP分布于所有的常染色體與X染色體上,每條染色體所含SNP最少為4個(gè),最多為9個(gè)。Y染色體因?yàn)樾坌源笫螵?dú)有,且多樣性低,故未選擇。

    1.4 DNA提取

    DNA提取采用TianGEN(天根生化科技有限公司)組織基因組抽提試劑盒,操作步驟依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。吸取1 mL抽提好的DNA,在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)其濃度,然后將所有的DNA樣本標(biāo)化到濃度為30 ng/mL,-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    圖1 所選取SNP位點(diǎn)在大鼠基因組上的分布

    1.5 引物設(shè)計(jì)

    引物用Primer3在線軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì)[21],并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小在200~250 bp,引物長(zhǎng)度為20~30 bp,熔解溫度(Tm)為55~65 ℃,GC含量為20%~80%。為了區(qū)分不同的樣品,設(shè)計(jì)了96對(duì)含有索引序列和通用序列的條形碼引物。最后使用Illumina公司的P5與P7引物,統(tǒng)一建庫(kù)。大鼠位點(diǎn)使用特異性引物見(jiàn)表1。

    1.6 靶向SNP建庫(kù)和測(cè)序

    建庫(kù)策略:第一輪PCR反應(yīng)以大鼠基因組DNA為模板,在兩端加上特異引物和接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增;第二輪PCR擴(kuò)增使用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板,使用與接頭匹配的通用引物,同時(shí)在引物兩端加上后續(xù)測(cè)序所需要的標(biāo)簽。PCR的測(cè)序策略如圖2所示。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化為95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 2 min,72 ℃ 30 s,進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)[7]。建庫(kù)產(chǎn)物送金唯智生物(蘇州金唯智生物科技有限公司,中國(guó)蘇州)進(jìn)行高通量測(cè)序,使用機(jī)型為illumina X-10,上機(jī)前產(chǎn)物經(jīng)安捷倫2100質(zhì)控。

    1.7 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析和SNP的識(shí)別

    所有的測(cè)序數(shù)據(jù)用FASTX-Toolkit[8]根據(jù)每一條序列的索引序列分配到不同的樣本中,再將索引序列和接頭序列用Cutadapt[9]軟件去除。所得到的干凈序列使用bwa[10]軟件和參考基因組比對(duì)得到sam格式的文件。所得的sam格式文件通過(guò)samtools[11]軟件得到mpileup文件,然后生成最終報(bào)告。對(duì)于SNP的檢出,過(guò)濾小于15×測(cè)序深度位點(diǎn),雜合子判定標(biāo)準(zhǔn)為等位基因的序列讀長(zhǎng)比例在20%~80%。

    表1 大鼠位點(diǎn)使用特異性引物

    圖2 兩步法Hi-SNP建庫(kù)流程

    圖3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程

    2 結(jié)果與討論

    2.1 擴(kuò)增子均一性

    樣本均一性對(duì)于靶向重測(cè)序是非常重要的性能指標(biāo),這將決定在平均測(cè)序深度下的SNP測(cè)定率。在這批樣本中總擴(kuò)增子數(shù)量4 205個(gè),根據(jù)SNP鑒定時(shí),有效深度大于等于15×,其中有3 607個(gè)擴(kuò)增子獲得有效覆蓋度,即有效擴(kuò)增子的數(shù)量為85.8%,深度的平均值為446×,深度的中值為229×。本批樣本85.8%的擴(kuò)增子最后獲得SNP數(shù)據(jù)(圖4)。

    隨后,每個(gè)擴(kuò)增子深度對(duì)平均深度進(jìn)行了歸一化,如此則可直接觀察到平均測(cè)序深度對(duì)每個(gè)擴(kuò)增子的影響,即可評(píng)價(jià)總體均一度。從圖5可以看出,大部分的數(shù)據(jù)分布于平均深度的10倍范圍以?xún)?nèi),有較高的總體均一度,從而使總體測(cè)序量得以降低。

    圖4 大鼠擴(kuò)增子測(cè)序深度

    圖5 擴(kuò)增子相對(duì)深度累計(jì)曲線

    2.2 Hi-SNP特異性

    從圖6可以明顯看出,測(cè)序深度的增加,使得雜合子二等位基因比例向1∶1靠攏,而純合子的非特異等位基因數(shù)目比例則下降,即有效測(cè)序深度的增加有利于提高SNP的準(zhǔn)確性。

    圖6 SNP位點(diǎn)等位基因比例

    如圖7所示,從各品系大鼠SNP等位基因所在reads比例來(lái)看,該批次F344大鼠、GK大鼠、SHR大鼠和WKY大鼠絕大部分樣本為純合子,為近交系大鼠,符合遺傳質(zhì)量檢測(cè)的要求。雜合子絕大部分來(lái)源于SD大鼠,為封閉群大鼠。

    圖7 各品系大鼠SNP位點(diǎn)等位基因reads比例

    2.3 SNP位點(diǎn)在品系間的差異分析

    運(yùn)用mega軟件,采用極大似然法查看各品系大鼠之間的遺傳距離。各品系大鼠,除SD大鼠,基本上聚集在一起。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)SHR大鼠和WKY大鼠與其他品系大鼠有較大的差異。

    圖8 各大鼠運(yùn)用極大似然法構(gòu)建的聚類(lèi)圖

    多重PCR靶向二代測(cè)序SNP分型方法相比于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)以及生物化學(xué)方法有著明顯優(yōu)勢(shì),主要體現(xiàn)在通量大、建庫(kù)方便、測(cè)序深度高、性?xún)r(jià)比高、特異性強(qiáng)、分辨率高和價(jià)格低廉等方面。

    高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,也使大規(guī)模樣本的基因組目標(biāo)區(qū)域及候選基因區(qū)域的測(cè)序成為可能。由此而建立的基于高通量測(cè)序的SNP分型技術(shù),即是利用多重PCR,獲得含有目的的SNP位點(diǎn)基因組片段,定量混合后測(cè)序。相較于傳統(tǒng)的PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng))、PCR-SSCP(聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析),直接測(cè)序和基因芯片等SNP分型方法,具有以下優(yōu)勢(shì):(1)針對(duì)性強(qiáng),目標(biāo)區(qū)域測(cè)序更有針對(duì)性,可以依賴(lài)大量的前期研究成果,獲得候選染色體區(qū)域片段;(2)信息量大,目標(biāo)區(qū)域測(cè)序可以完整覆蓋整個(gè)基因區(qū)域,不僅可以獲得高頻SNP的分型數(shù)據(jù),還可以發(fā)現(xiàn)低頻的和個(gè)體特有的變異;(3)費(fèi)用低,多重PCR是一種高效、高產(chǎn)率的目標(biāo)DNA富集技術(shù),比起液相雜交,Long PCR擴(kuò)增等富集技術(shù),能提高富集效率,加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,結(jié)合高通量測(cè)序,同時(shí)可對(duì)數(shù)百個(gè)樣本進(jìn)行快速測(cè)序,大大降低了研究成本。

    3 結(jié)論

    鑒于國(guó)內(nèi)應(yīng)用SNP標(biāo)記分析通量相對(duì)較低,且尚未建立針對(duì)我國(guó)常用大鼠進(jìn)行系統(tǒng)而有效遺傳檢測(cè)的高通量SNP位點(diǎn)組合(SNPpanel)、SNP遺傳檢測(cè)的方法及判定標(biāo)準(zhǔn)上的現(xiàn)狀,本研究通過(guò)高通量多重PCR技術(shù)聯(lián)合二代測(cè)序,優(yōu)化出一套可用于大鼠品系遺傳質(zhì)量快速檢測(cè)的高通量SNP鑒定方法,并易于標(biāo)準(zhǔn)化流程,有利于提高我國(guó)大鼠遺傳質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。

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